TRPC1蛋白和脂筏在fMLP诱导的中性粒细胞极性中的作用

发布时间：2018-01-03 05:33

本文关键词：TRPC1蛋白和脂筏在fMLP诱导的中性粒细胞极性中的作用　出处：《南方医科大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景中性粒细胞作为机体先天免疫应答的重要组成部分,在抵御外来微生物病原体尤其是化脓性细菌入侵中发挥着重要作用。一旦感知到趋化物质的存在,中性粒细胞迅速激活大量信号分子,瞬间建立起以头部宽大尾部狭窄为特征的极性形态。中性粒细胞建立并维持极性形态的能力是其定向迁移(趋化)到炎症部位,发挥杀菌抗炎作用的前提。虽然中性粒细胞在生理功能中发挥着重要作用,但在细胞建立极性形态过程中,任何信号分子的调控失败,都会导致中性粒细胞的异常激活,这与临床上一些疾病例如败血症、哮喘、缺血／再灌注损伤、类风湿性关节炎、过敏反应等密切相关。因此,研究调控中性粒细胞极性的分子机制,对防止中性粒细胞异常激活导致的组织损伤具有重要意义。中性粒细胞能够被大量趋化物质激活,例如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, fMLP),补体成份C5a (complement component factor5a),人白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)等,白细胞介素8(interleukin8,IL-8),血小板激活因子(pallet activated factor,PAF),单核细胞趋化蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP-2)等,其中来源于细菌的多肽fMLP刺激作用最强。静息的中性粒细胞大量存在于外周血循环中,呈现圆形,受到趋化剂刺激后,很快朝趋化剂方向建立起一个头部宽大的极性形态。细胞形态对称性打破需要细胞将胞外信号翻译并将胞内信号分子重新分布,如蛋白质和脂质等呈现不对称分布,细胞骨架结构重构等,从而有利于细胞呈现出极性的外形。中性粒细胞被趋化物质激活后,迅速启动胞内一系列复杂的信号级联反应,首先激活的是胞膜上的G蛋白耦联受体,它释放出Gβγ亚单位可激活大量下游信号分子,包括磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K),Rho小G蛋白,酪氨酸激酶和蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)等,其中PI3K是细胞极性的经典信号通路,它的脂质产物磷酯酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol3,4,5-trisphosphate, PIP3)聚集在极性细胞前极,这是募集和激活下游极性信号分子的重要事件。令人惊奇的是中性粒细胞不仅在梯度浓度的趋化剂刺激下发生极性和肌动蛋白(F-actin)重组,而且处于均一浓度的趋化剂环境中也能够形成头尾极性形态和出现actin重组,这种极性反应表明细胞内部一定存在着某种信号机制,使胞内极性信号分子呈现极性分布,这种机信号机制可以不受胞外趋化物浓度梯度的影响而调控细胞极性形态形成。寻找和鉴定这些内部信号分子,有助于阐明中性粒细胞激活的分子机制,并为治疗中性粒细胞异常激活相关疾病提供新的靶标。细胞内游离钙浓度(cytosolic free Ca2+concentration,[Ca2+],)变化参与中性粒细胞多种功能的调节,如趋化和迁移、活性氧的产生等。在非兴奋细胞中,[Ca2+]i是由两个密不可分的过程共同作用的结果,即内质网钙库快速释放和质膜钙通道开放介导的胞外钙内流。文献已报道人中性粒细胞由于缺乏电压门控钙通道(voltage-gated calcium channels, VGCC),胞外钙内流主要由内质网钙库清空引起质膜上的钙通道开放导致钙内流,即所谓的钙库操纵性钙离子通道(store-operated Ca2+entry, SOCE)。关于不同细胞型SOCE的分子组成一直是近年来的研究热点,学者们一致认为蛋白基质交互分子1(stromal interaction molecularl,STIM1)蛋白和Orai1蛋白是组成SOCE的两种必需蛋白分子,另一个重要候选分子是瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel, TRP)中C亚家族成员的TRPC1(TRP-canonical1)分子。TRPC1蛋白是位于细胞膜上的非选择性钙离子通道,有证据支持TRPC1蛋白参与骨髂肌成肌细胞的迁移,并且调控迁移细胞的方向。关于SOCE在中性粒细胞功能中的研究,Schnff等发现Orai1蛋白组成SOCE调节血流应切力下中性粒细胞阻滞、粘附和极性改变,另一研究小组Brechard等证实STIM1蛋白而不是STIM2蛋白参与组成SOCE钙内流介导NADPH氧化酶的活化。TRPC1蛋白作为SOCE重要的候选分子,目前尚不清楚在中性粒细胞功能的作用。因此有必要研究TRPC1信号分子在中性粒细胞极性中的作用,探讨其调控中性粒细胞极性的分子机制,为治疗中性粒细胞异常激活相关疾病提供新的理论依据。细胞发生极性和趋化需要大量信号酶分子在质膜不同区域激活和／或易位,位于胞膜上的脂筏(lipid rafts)作为信号组织平台是近些年的研究热点。过去很长一段时间认为细胞膜结构是均质的液态流动脂质双分子层,在信号转导通路中只是作为蛋白的支架(scaffold)发挥作用,越来越多的证据显示细胞膜并不是完全均质的结构,而是胞膜上存在着许多高度有序的液态微结构域,呈现胶冻样,其中化学成分主要是胆固醇和鞘磷脂,这种微结构域被称为脂筏。脂筏中的胆固醇能够被药物甲基-B-环糊精(methyl-β-cyclodextrin, MBCD)所包裹,导致脂筏结构完整性被破坏。有研究表明MBCD处理中性粒细胞后,抑制了fMLP诱导的中性粒细胞极性和迁移,提示脂筏是中性粒细胞极性不可缺少的结构。脂筏就像一个蛋白质停泊的平台,组装了大量的信号分子,与膜的信号转导、蛋白质分选均有密切关系。探讨膜蛋白TRPC1信号分子是否需要借助脂筏信号平台调控中性粒细胞的极性,有助于深入阐明TRPC1蛋白调节中性粒细胞极性的分子机制。为了阐明TRPC1蛋白和脂筏在中性粒细胞极性中的作用及其机制,本研究采用均一低浓度的fMLP刺激人中性粒细胞建立极性模型,由于该细胞难于基因操作,全部实验拟采用药理学方法,用2-APB, SKF96365,狼蛛毒素GsMTx-4或破坏脂筏结构的特异药物(MβCD)预处理中性粒细胞,通过观察细胞形态和胞内骨架蛋白分子聚合F-actin的分布,分析Rho小G蛋白Rac2和Cdc42以及PI3K的标志性下游分子Akt蛋白的活性变化,探讨TRPC1通道阻断和脂筏破坏对fMLP诱导的中性粒细胞极性的影响,阐明TRPC1信号分子和脂筏与中性粒细胞极性的关系。进一步研究TRPC1蛋白和脂筏在中性粒细胞极性中的关系,即TRPC1蛋白是否需要组装进脂筏才能调控中性粒细胞的极性,深入阐明TRPC1蛋白调控中性粒细胞极性的分子机制,为防止和治疗中性粒细胞异常激活提供新的靶标。方法 1.采用经典的密度梯度离心法分离中性粒细胞,主要包括红细胞沉降,淋巴细胞分离液密度梯度离心和低渗裂解残存的红细胞三个步骤。首先葡聚糖T-500(dextran T-500)沉降红细胞可以除去绝大多数红细胞,接下来淋巴细胞分离液密度梯度离心可将外周血单个核白细胞与多型核白细胞分开,残存的红细胞通过低渗溶胀快速移除。获得的中性粒细胞进行瑞氏和台盼蓝染色,分析细胞活性和纯度,细胞的活度和纯度分别大于98%和95%。 2.提取人中性粒细胞总RNA,开展荧光定量RT-PCR检测人中性粒细胞表达的TRPC亚型类型,免疫荧光检测中性粒细胞中TRPC1蛋白表达水平。 3.采用2-APB, SKF96365, GsMTx-4或Mβ3CD预处理中性粒细胞15分钟,同时设立空白对照组,借助Zigmond Chamber建立fMLP的线性浓度梯度,观察fMLP刺激中性粒细胞后的形态变化,记录极性细胞数量。 4.采用GST pull down方法检测活性Rac2蛋白和Cdc42蛋白的表达,开展Western-blotting检测Rac2蛋白,Cdc42蛋白,P-Akt473蛋白,P-Akt308蛋白的表达。 5.应用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜上检测聚合F-actin, TRPC1蛋白和脂筏在中性粒细胞内的分布。 6.采用超高速冷冻离心方法将膜蛋白分为脂筏区蛋白和非脂筏蛋白两部分,开展Western-blotting方法检测fMLP刺激组和脂筏破坏后再孵育fMLP组的TRPC1蛋白在不同部分的表达情况。结果 1.人中性粒细胞在mRNA水平表达TRPC1,TRPC3,TRPC4和TRPC6,其中RPC6表达丰度较高,TRPC1较低。免疫荧光结果表明人中性粒细胞表达TRPC1蛋白。 2.静息的中性粒细胞几乎全部呈现圆形或近似圆形,有8.32±2.43%的细胞发生极性,细胞极性的方向是随机的,没有规律性。而暴露于fMLP浓度梯度的细胞,绝大多数(85.91±10.44%)呈现头部宽大和尾部狭窄的极性形态,极性细胞头部朝趋化物浓度梯度方向的细胞占观察细胞的68.10±9.40%。在fMLP刺激前用100μM2-APB,10μM SKF96365,5μM GsMTx-4和lOmM MβCD预处理的中性粒细胞中,细胞极性率均不超过30%,分别为21.91±4.76%,25.53±10.95%,27.37±2.85%和21.59±4.67%,均低于fMLP刺激组的极性率(P0.001)。沿fMLLP浓度梯度方向极性的细胞占观察总细胞的百分比分别为13.14±3.40%,15.50±6.34%,18.68±1.32%和15.26±4.56%,与fMLP刺激组的极性率68.10±9.40%比较均有统计学差异(P0.001)。 3.聚合的F-actin在免疫荧光下显示为红色,静息状态的中性粒细胞中质膜下红色荧光呈现出圆形分布,荧光强度非常弱且相对弥散. fMLP刺激后的中性粒细胞中出现明显不对称的明亮红色荧光,主要聚集在细胞头部,且荧光强度增强。而2-APB, SKF96365, GsMTx-4或MβCD预处理的的细胞内聚合F-actin荧光虽然比静息细胞强,但在细胞中呈现相对均匀的分布。 4. fMLP刺激组中性粒细胞的活性Rac2蛋白和Cdc42蛋白表达水平均高于对照组(P0.05)。但fMLP刺激前用2-APB,SKF96365, GsMTx-4或MβCD预处理的细胞中,活性形式的Rac2蛋白和Cdc42蛋白表达水平均低于fMLP刺激组(P0.05),与对照组中性粒细胞中表达水平相近。 5. fMLP刺激中性粒细胞0,30s,60s,120s,300s五个不同时间,各组胞内P-Akt473蛋白的表达无明显变化。fMLP刺激前用2-APB, SKF96365, GsMTx-4或MBCD预处理的中性粒细胞,其胞内P-Akt473和P-Akt308的蛋白表达水平与对照组和fMLP刺激组相似,呈现非常弱的蛋白条带。 6.在激活的中性粒细胞中脂筏(红色荧光)明显聚集在细胞头部成帽状,TRPC1蛋白(绿色荧光)有向头部集中趋势,两者在胞内分布相一致。在MBCD预处理的细胞中脂筏与TRPC1蛋白的呈现相对均匀的分布,与对照组相似。 7. fMLP刺激组中TRPC1蛋白主要分布在脂筏区,而fMLP刺激前用MβCD破坏脂筏结构的中性粒细胞中,TRPC1蛋白在脂筏区蛋白量明显减少。结论 1.人中性粒细胞在mRNA水平表达TRPC1, TRPC3, TRPC4和TRPC6四种TRPC通道亚型,人中性粒细胞表达TRPC1蛋白。 2. TRPC1通道蛋白和脂筏均正向调节fMLP诱导的人中性粒细胞极性发生和聚合F-actin的胞内极性分布。 3. TRPC1蛋白和脂筏均上调极性性号分子Rac2蛋白和Cdc42蛋白的活性水平,从而实现对中性粒细胞极性的调控。 4.未发现丝氨酸/苏氨酸激酶Akt参与TRPC1蛋白和脂筏所介导的中性粒细胞极性信号通路。 5. TRPC1蛋白被组装进脂筏信号平台中有利于中性粒细胞极性形态形成和骨架蛋白的重组。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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