LP（a）对小鼠骨髓源性内皮祖细胞损伤作用的初步研究

发布时间：2018-01-04 03:08

  本文关键词：LP（a）对小鼠骨髓源性内皮祖细胞损伤作用的初步研究　出处：《南华大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：初步探讨心血管疾病独立危险因子脂蛋白（a）[LP（a）]对小鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）的损伤作用及其可能的机制。 方法：实验分为6组：①对照组，加等量含200μmol/L EDTA的全培养液；②1μg/ml的LP（a）处理组，③10μg/ml LP（a）处理组，④100μg/ml的LP（a）处理组，⑤300μg/ml LP（a）处理组，⑥600μg/ml LP（a）处理组。贴壁法分离与培养内皮祖细胞（EPCs），摄取ac-LDL和结合UEA-1鉴定EPCs，MTT法检测细胞存活与增殖，transwell测定细胞迁移，明胶粘附法测定EPCs的粘附，基质胶上种植EPCs，photshop7.0计算血管长度，显微镜下观测单个细胞克隆大小和克隆数目，RT-PCR和western blotting分别检测一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA水平和蛋白表达情况，细胞免疫组织化学技术检测eNOS蛋白在EPCs的表达和分布情况，并采用DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧（ROS）的量，采用Griess试剂法测定一氧化氮（NO）水平。 结果：①采用贴壁法能从小鼠鼠骨髓的单个核细胞中分离出纯度达70%以上的EPCs。②LP（a）剂量依赖性影响EPCs存活，100μg/ml LP（a）开始对EPCs产生一定的破坏作用，300μg/ml LP（a）对EPCs的破坏作用急速加大。③1μg/mlLP（a）即能显著抑制EPCs的迁移，当LP（a）浓度达到10μg/ml时，迁移到下槽的细胞数目大大减少，其迁移细胞数不到对照组的1/6，LP（a）浓度为100μg/ml时，其迁移细胞数减少到对照组的1/9，300μg/ml时其迁移细胞数约为对照组的1/14。④LP（a）剂量依赖性抑制EPCs的粘附。1μg/ml的LP（a）可明显减少EPCs粘附细胞数目（145.2±8.4个/每个视野vs115.2±12.6个/每个视野，P＜0.05，n=5），当LP（a）的浓度达到10μg/ml时，EPCs粘附能力进一步下降，下降到对照组的1/2，当LP（a）的浓度达到100μg/ml时下降到对照组的约1/3，当LP（a）的浓度达到300μg/ml时，EPCs粘附能力下降最显著，，其下降到对照组的约1/16。⑤EPCs经10μg/ml LP（a）处理后，血管形成能力的明显受到损伤，当LP（a）的浓度增加到100μg/ml时，EPCs的血管形成能力大大减弱，已经不到对照组的1/4（36.34±1.54mm/每个视野vs8.76±0.62mm/每个视野，P＜0.001，n=5）；当LP（a）的浓度增加到300μg/ml时，差不多已经见不到完整的血管样结构。⑥经100μg/ml的LP（a）处理后，不但克隆数目明显减少（10.2±1.3vs3.1±0.4，P＜0.01，n=5），而且克隆生长明显受到抑制。⑦机制研究发现： EPCs经过100μg/ml的LP（a）处理后， eNOS mRNA和蛋白表达均显著下调，一氧化氮（NO）显著减少（36.35±3.91vs3.91±0.79，P＜0.001，n=3）。活性氧检测结果表明，在1μg/ml LP（a）作用下，活性氧产生显著增加（1±0.12vs3.92±0.36，P＜0.05，n=5）；当LP（a）的浓度为10μg/ml时，荧光强度是对照组的近15倍；当LP（a）的浓度为100μg/ml时，与前述各组相比较，胞内绿色荧光强度和发出绿色荧光的细胞均增多（图12D），其荧光强度是对照组的31倍多，是1μg/mlLP（a）的近8倍，是10μg/ml LP（a）的2倍多。 结论： ①LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs增殖； ②LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs迁移； ③LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs粘附； ④LP（a）浓度依赖性地抑制EPCs血管形成能力； ⑤LP（a）抑制EPCs的克隆形成； ⑥LP（a）对EPCs的损伤作用与抑制eNOS表达和NO生成有关，还与促进活性氧生成有关。
[Abstract]:Objective: to preliminarily explore the damage effect and possible mechanism of lipoprotein (a) [LP (a)] on the bone marrow derived endothelial progenitor cells (EPCs) of mice.
Methods: the experiment was divided into 6 groups: the control group, the medium with equal volume containing 200 mol/L EDTA; the 1 g/ml LP (a) treatment group, the 10 g/ml LP (a) treatment group, the 100 g/ml LP (a) treatment group, the 300 g/ml LP (a) treatment group, the 600 g/ml LP (a) treatment group. And cultured endothelial progenitor cells adherent (EPCs), uptake of ac-LDL and identification of EPCs combined with UEA-1, MTT method to detect cell survival and proliferation, Transwell determination of cell migration, adhesion assay of EPCs gelatin adhesion method, planting EPCs gel matrix photshop7.0, calculate the vessel length, the number of observations under a microscope single cell clone size and cloning, RT-PCR and Western blotting were used to detect the nitric oxide synthase (eNOS) expression levels of mRNA and protein, immunohistochemical detection of eNOS protein in the expression and distribution of EPCs, and DCFH-DA staining was used to detect the intracellular active oxygen method (ROS). Griess reagent method was used to determine the level of nitric oxide (NO).
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本文编号：1376766