海马神经元雄激素膜受体的定位及其快速作用

发布时间：2018-01-06 03:35

  本文关键词：海马神经元雄激素膜受体的定位及其快速作用　出处：《河北医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：以原代培养海马神经元为研究对象，观察睾酮-牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素（T-BSA-FITC）与海马神经元胞膜结合情况，验证海马神经元细胞膜雄激素特异性结合位点（膜受体）的存在；研究睾酮对原代培养海马神经元Ca~2+和钙调蛋白（CaM）的快速作用，为海马神经元雄激素膜受体介导的非基因组作用研究提供实验依据。 方法： 1、原代海马神经元培养、形态观察及鉴定：新生1d内SD大鼠乳鼠，无菌条件下断头取脑，剥离海马，去除血管和软脑膜，剪碎海马组织，胰酶消化。DMEM（10%NBCS）终止消化。机械性分散成单细胞悬液，以5～10×10~5/ml密度接种于包被有多聚赖氨酸的培养板上。细胞在CO_2培养箱内孵育，培养24h内，更换培养基为含L-谷氨酰胺和2%B27的Neurobasal。MTT法绘制细胞生长曲线，细胞免疫荧光化学方法鉴定神经元及其纯度。 2、海马神经元雄激素膜受体定位研究：取培养8～10天的原代海马神经元，加入T-BSA-FITC37°C作用15min，激光共聚焦显微镜下观察雄激素复合物的亚细胞定位。BSA-FITC作为阴性对照组。另设竞争性实验，用过量游离T提前作用神经元15min后再加入T-BSA-FITC继续作用15min，观察T-BSA-FITC与胞膜结合情况，验证海马神经元是否存在雄激素膜受体。 3、研究雄激素对海马神经元Ca~2+的快速作用：Ca~2+敏感荧光染料Fluo4-AM对原代培养海马神经元进行负载，激光共聚焦显微镜记录10~-7MT干预前后细胞内Ca~2+的变化。每隔2s记录一次，共记录30min。 4、研究雄激素对海马神经元CaM的快速作用：应用免疫荧光细胞化学技术观察10~-7M T作用于海马神经元0min、15min、30min、1h和2h CaM的表达情况。 结果： 1、原代海马神经元培养，6～8h开始贴壁，培养24h后大部分神经元贴壁并伸出突起，培养3d神经元突起增多并延长。随着培养时间延长，胞体增大，丰满，突起进一步增粗延长，交织成网络。细胞呈多极神经元，形态多样，有锥形、三角形、梭形、椭圆形等等。培养3w后，细胞开始退化，胞质中出现颗粒空泡，，突起退化、核固缩崩解。MTT法绘制生长曲线：潜伏生长期（2～4d）,生长期（4～10d），此时细胞生长较快，发育成熟，之后处于达到平稳状态（11d～）。经NeuN免疫细胞化学染色，Hoechst33258复染细胞核，证明是神经元，计数阳性细胞率大于95%。 2、海马神经元雄激素膜受体定位研究结果：T-BSA-FITC组，部分神经元胞膜上有特异性荧光，其神经突起起始部亦有荧光，而内部无特异性标记。在同样孵育条件下BSA-FITC没有结合到神经元上。游离T预先孵育几乎未检测到任何荧光染色，表明T预先孵育可以完全阻断T-BSA-FITC膜结合作用。 3、雄激素对海马神经元Ca~2+的快速作用研究结果：原代海马神经元Fluo4-AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜下给予T处理，部分神经元在给药后数分钟内细胞内钙有增高，并可诱发出细胞内钙波动，峰值较基础值增高3.45±0.20倍，且峰值出现在给药后20min内。 4、雄激素对海马神经元CaM的快速作用研究结果：T干预各时间组CaM荧光强度较0min组（46.49±1.15）均增加（P0.05）。其中15min组（101.74±2.88）和30min组（103.27±2.80）荧光强度增加明显；1h组（85.10±2.23）和2h（81.65±1.68）组荧光强度增加程度弱于15min组和30min组（P0.05）。 结论: 1、出生24h以内的SD大鼠乳鼠，体外无血清培养技术可以成功培养出原代海马神经元，经鉴定细胞纯度达到95%以上，培养8～10d可用于实验。 2、海马神经元细胞膜存在睾酮特异性结合位点（膜受体），且该位点可以被游离T竞争性结合。 3、T作用于原代培养海马神经元可以引起部分细胞内Ca~2+和CaM的快速变化，其作用可能是通过雄激素膜受体介导的快速非基因组效应实现的。
[Abstract]:Objective: primary cultured hippocampal neurons as the research object, testosterone - bovine serum albumin - fluorescein isothiocyanate (T-BSA-FITC) combined with hippocampal neuronal membrane, validate androgen specific membrane binding sites in hippocampal neurons (membrane receptors) exist; the research of testosterone Ca~2+ and calmodulin on primary cultured hippocampal neurons (CaM) the rapid effect, to provide the experimental basis for the study of nongenomic effects of hippocampal neurons of androgen receptor mediated.
Method锛

本文编号：1386131