表达HIV-1gag基因的重组腺病毒疫苗的药效学研究

发布时间：2018-01-06 10:15

本文关键词：表达HIV-1gag基因的重组腺病毒疫苗的药效学研究　出处：《北京工业大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：艾滋病（AIDS），是当今对人类健康威胁最大的疾病之一，自从引起艾滋病的HIV病毒被发现以来，科学家们始终致力于寻找科学有效的预防和治疗手段，但由于HIV本身高度变异性及易于产生耐药性的特点，至今仍然没有研制出治愈艾滋病的有效药物。从疾病控制长远战略来说，有效的HIV疫苗才是战胜HIV流行的最佳希望。本课题组前期进行了多载体HIV疫苗序贯及重复免疫的研究，接受免疫的动物体内可长期维持高水平细胞免疫反应。本研究主要对表达gag基因的重组腺病毒疫苗（Ad5-HIVgag）进行临床前药效学研究，，为该疫苗的临床应用提供依据。腺病毒载体一直是基因治疗和疫苗研究的热点，这主要是由于腺病毒载体具有安全性高、宿主范围广泛、感染滴度高、稳定性好，腺病毒双链DNA基因组易于重组基因操作等特点。核心蛋白Gag具有较高的保守性，富含CTL表位，是细胞免疫应答的主要靶标。Ad5-HIVgag疫苗是插入了HIV-1gag基因的、缺失病毒E1及E3区的非复制型5型重组腺病毒。疫苗中gag基因来自HIV-1B亚型gag共享序列。本研究首先对Ad5-HIVgag疫苗检定的PCR方法、酶切方法、Western blot方法及ELISpot方法进行了方法学验证并制定了相应的质量检定规程。对纯化的三批重组Ad5-HIVgag疫苗制品进行了相应的质量检定。用PCR方法可以扩增出gag特异性产物，酶切方法证明HIV-1gag基因插入位置正确，Western blot方法证实Gag蛋白可以有效表达，免疫小鼠后用ELISpot方法可检测到Gag特异性细胞免疫反应。本研究重点评价了小鼠及猴体内的细胞免疫反应效果。用不同剂量的Ad5-HIVgag疫苗（2×10~6VP/只/次、2×10~7VP/只/次、2×10~8VP/只/次、2×10~9VP/只/次、2×10~(10)VP/只/次）局部肌肉注射小鼠两次或三次，最后一次免疫后1周用ELISpot方法检测Gag特异性细胞免疫反应。结果2×10~6VP的剂量就可以在小鼠体内获得明显的细胞免疫应答。以2×10~7VP的剂量注射产生的细胞免疫反应水平最高，当高于此剂量时，细胞免疫水平反而降低。为观察Ad5-HIVgag疫苗在食蟹猴体内所引起的特异性免疫反应，在猴长毒试验过程中同时进行了药效学观察。分别使用低（0.99×1011VP/只/次）、中（4.94×1011VP/只/次）、高（24.68×1011VP/只/次）不同的病毒剂量，肌肉注射食蟹猴，于0、3、6、9、12周各肌肉注射1次。于不同时间点用ELISpot方法检测疫苗诱导的Gag特异性细胞免疫反应，同时也检测了动物血清抗腺病毒的中和抗体。结果从初次免疫后5周开始，免疫的动物即检测到了Gag特异性细胞免疫反应，随着时间的延长，8周时Gag特异性细胞免疫反应水平有增加。12周时Gag特异性细胞免疫反应水平有所下降，但随后15周及18周的检测，Gag特异性细胞免疫反应水平又有升高。说明，食蟹猴在一定的剂量范围内用Ad5-HIVgag免疫后，可产生针对Gag的特异性免疫反应。三个实验组动物都检测到了较高水平的腺病毒中和抗体，但是对Ad5疫苗反复应用诱导的Gag特异性细胞免疫反应抑制作用并不明显。总之，Ad5-HIVgag疫苗可以诱导机体产生Gag特异性T细胞应答，有可能成为治疗艾滋病的有效疫苗。依据国家对生物制品注册的管理规定，对Ad5-HIVgag疫苗相关的质量研究及药效学研究资料进行了整理，并已向北京市药品监督管理局递交了Ⅰ期临床研究申请。
[Abstract]:AIDS ( AIDS ) is one of the greatest threats to human health . Since AIDS - induced HIV virus has been discovered , scientists have been working to find effective drugs to prevent and cure AIDS . In the long - term strategy of disease control , effective HIV vaccine is the best hope to overcome the HIV epidemic . In the early stage of this study , effective HIV vaccine is the best hope to overcome the HIV epidemic . The adenovirus vector has been a hot spot for gene therapy and vaccine research , which is mainly characterized by high safety , wide host range , high infection titer , good stability , easy recombination gene operation of adenovirus double - stranded DNA genome . The core protein Gag has high conservative property and CTL epitopes , and is the main target of cellular immune response . The Ad5 - HIV gag vaccine is a non - replicating type 5 recombinant adenovirus inserted with HIV - 1 gag gene and deleted virus E1 and E3 region . The gag gene of the vaccine is from gag shared sequence of HIV - 1B subtype . In this study , the PCR method , enzyme - cutting method , Western blot method and pot method of Ad5 - HIV gag vaccine were verified and the corresponding quality test procedure was established . The specific product of gag was amplified by PCR . The method of PCR proved that the inserted position of HIV - 1 gag gene was correct , and Western blot was used to demonstrate that Gag protein could be expressed effectively , and the immune response of Gag - specific cell could be detected after immunized mice . The specific immune responses of Gag - specific cells were detected in mice at different time points . The results showed that the immune response of Gag - specific cells was observed at the dose of 2 脳 10 ~ 7 VP . In conclusion , the Ad5 - HIV gag vaccine can induce the organism to produce Gag - specific T cell response , which may become an effective vaccine to treat AIDS . According to the State regulations on the registration of biological products , the quality research and pharmacodynamics research data related to the Ad5 - HIV gag vaccine have been collated and submitted to the Beijing Drug Administration Bureau for application for clinical study .

【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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