旋毛虫肠期抗原基因的沙门氏菌运载体研究
本文关键词：旋毛虫肠期抗原基因的沙门氏菌运载体研究 出处：《吉林大学》2012年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：旋毛虫病是一种在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病，给我国的畜牧生产和食品安全造成持续性危害。旋毛虫感染宿主主要有两个特点：调节宿主机体发生免疫抑制和诱导宿主肌细胞分化为保姆细胞。以往的研究发现旋毛虫排泄分泌抗原ES（Excreat/Secreatproduct）在这两个过程中发挥重要作用。由于旋毛虫ES成分复杂且难于收集，对其中特定抗原成分进行纯化较为困难；而原核表达抗原蛋白又存在缺乏修饰及丧失活性等问题，因此从分子水平研究ES在旋毛虫与宿主互作过程中的功能还存在着很大局限。沙门氏菌是一种能感染人和动物的致病性细菌，由于其遗传背景清晰，易于减毒和操作，目前许多研究将减毒沙门氏菌作为基因运载体用于疫苗的研究和抗肿瘤基因免疫研究。携带外源真核质粒的沙门氏菌经过口服到达肠道后，被肠道淋巴组织的抗原递呈细胞(Antigen Presentation Cell，APC)捕获、裂解后释放出真核质粒，质粒在宿主细胞中启动转录并表达目的基因。由于抗原递呈细胞具有游走性，目的基因除了在肠道相关淋巴组织中表达，还可由抗原递呈细胞运送至全身各处淋巴组织中表达，因此理论上减毒沙门氏菌载体也可作为研究某种特定基因功能的有效工具。本实验首次以研究基因功能为目的利用减毒沙门氏菌将旋毛虫抗原基因携带到宿主体内，并观察目的基因对宿主免疫系统的影响。 T626-55和T668是本实验室通过对旋毛虫不同时期cDNA进行免疫筛选和抑制性差减杂交文库（Suppression Subtractive Hybridization）筛选得到的两种重要的旋毛虫抗原基因，分别编码旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和新生幼虫时期丝氨酸蛋白酶。两者可能在旋毛虫与宿主互作方面发挥重要作用。本研究通过RT-PCR从肌幼虫和新生幼虫cDNA中调取目的基因，并连接到真核表达载体pcDNA3.1上，成功构建了重组质粒T626-55-pcDNA3.1和T668-pcDNA3.1。将重组质粒分别通过脂质体介导转染小鼠BHK细胞系，免疫荧光分析显示重组质粒在真核细胞中成功得到了表达。然后分别将重组质粒转化减毒沙门氏菌PhoP/PhoQ（PQ）株，获得携带这两个基因的重组菌株T626-55-PQ和T668-PQ。两者通过口服感染小鼠后，利用RT-PCR和组织间接免疫荧光实验来检测目的基因在脾脏中的转录和表达。结果显示外源基因在体内成功地转录和表达。 为了研究表达这两种外源基因对宿主免疫系统的影响，本实验对感染T626-55-PQ和T668-PQ后引起宿主的体液免疫和细胞免疫变化进行了初步检测，并同时评价了其对宿主感染旋毛虫后收集虫体数量的影响。细胞增殖实验显示两种重组菌均可诱导宿主的细胞免疫反应。ELISA实验结果表明T626-55-PQ可诱导机体产生特异性IgG和肠道分泌特异性IgA；而T668-PQ感染后却不诱导产生特异性的IgG和IgA抗体。利用Real-Time PCR对脾细胞T-bet因子和GATA-3因子的转录水平检测，显示感染T626-55-PQ和T668-PQ后T-bet因子皆无明显变化而GATA-3因子明显升高，两种蛋白都调节宿主免疫向Th2方向偏移。感染T626-55-PQ和T668-PQ后对宿主荷虫数量变化效果通过成虫回收率、雌虫生殖率和肌幼虫回收率三个指标进行评价。结果显示T626-55导致旋毛虫雌虫生殖率明显降低，新生幼虫虫体体积减小；T668导致成虫回收率降低，，而肌幼虫回收率升高。 综上所述，本研究利用减毒沙门氏菌PQ株为载体成功地使旋毛虫T626-55和T668抗原基因在小鼠体内得到了表达，并通过细胞免疫、体液免疫、转录因子及虫体数量的评估推测这两个基因的功能。结果显示，T626-55基因可能与旋毛虫的发育和性成熟有关；T668基因参与免疫排虫的启动和旋毛虫对宿主的免疫抑制。本研究证实利用减毒沙门氏菌为载体对病原体抗原功能进行研究这一途径是切实可行的。
[Abstract]:Trichinosis is a kind of pathogenic bacterium which can infect humans and animals . It has two characteristics : regulating host organism ' s immune suppression and inducing host muscle cell to differentiate into cells . The recombinant plasmids T626 - 55 - pcDNA3.1 and T668 - pcDNA3.1 were successfully constructed by RT - PCR . The recombinant plasmids T626 - 55 - pcDNA3.1 and T668 - pcDNA3.1 were successfully constructed by RT - PCR . In order to study the effects of these two exogenous genes on host immune system , the effects of T626 - 55 - PQ and T668 - PQ on the humoral immunity and cellular immune changes of host were investigated . The results showed that T626 - 55 - PQ induced specific IgA in the host . The results showed that T626 - 55 - PQ and T668 - PQ could induce specific IgG and IgA antibody . In conclusion , the results showed that T626 - 55 gene might be related to the development and sexual maturation of trichina . The results showed that T626 - 55 gene might be related to the development and sexual maturation of trichina .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R383
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本文编号：1396238
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