MicroRNA-26对大鼠心脏重构的调控作用

发布时间：2018-01-11 03:29

本文关键词：MicroRNA-26对大鼠心脏重构的调控作用　出处：《广州医学院》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【背景】心脏重构(cardiac remodeling)是心脏在受到损伤或血液动力学改变等应激反应时,由于基因表达和蛋白调控的失常,导致心脏的结构和功能发生变化的病理过程。持续的心脏重构最终将导致心力衰竭(心衰,heart failure),并且是临床患者心律失常和猝死的重要原因。目前逆转心脏重构的手段仍较缺乏,之前的研究主要集中在心脏重构发病的神经体液和信号转导通路的翻译后调控,对于转录后调控的机制研究较少。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长度约19~25 nt的单链非编码RNA分子,通过与靶基因的结合,抑制或降解靶基因的mRNA,实现转录后水平的负调控。研究表明,在心脏重构过程中,许多miRNA的表达水平发生改变。其中,miRNA的表达谱芯片的结果显示,miR-26在心脏重构动物模型心肌组织中的表达下调,因此,我们假设:通过功能获得和缺失(gain-and loss-of-function)实验,在心脏细胞中上调或下调miR-26的表达,可能会引起心脏细胞的表型发生变化;另外,结合生物信息学软件的预测,GSK3β很可能是miR-26的靶基因之一,而GSK3β是心脏重构/心衰发病过程中的重要信号转导通路,miR-26可能会通过调控GSK3β的表达,进而影响心脏重构。为此,我们通过建立心脏重构大鼠动物模型和细胞模型,首先明确miR-26在心脏重构中的表达特征,进而通过体外实验,阐明miR-26的表达变化对心脏肥大和纤维化的影响,并验证miR-26是否以GSK3β为靶点,为进一步阐明心脏重构/心衰的发病机制和寻找新的治疗靶向提供实验依据。一、研究目的 1.阐明miR-26在大鼠心脏重构动物模型和细胞模型中的角色; 2.通过细胞实验,明确miR-26、GSK3β和心脏重构三者之间的关系。二、研究方法 1.腹主动脉缩窄法(transverse abdominal aortic constriction,TAAC)建立大鼠压力过负荷心脏重构模型,用动物心脏彩超、QPCR和western blot检测、病理组织切片染色等方法证实压力过负荷心脏重构模型建立成功。 2. QPCR法检测TAAC大鼠心肌组织和血浆miR-26的表达水平。 3.体外分离培养新生SD大鼠原代心肌细胞(CM)和心脏成纤维细胞(CF),QPCR法检测正常培养和AngiotensinⅡ刺激后,CM和CF miR-26的表达水平。 4. CM和CF转染miR-26 mimics和inhibitor后,QPCR法检测miR-26的表达变化。 5. CM和CF先转染miR-26 mimics再用AngiotensinⅡ诱导,或CM和CF单独转染miR-26 inhibitor,QPCR和western blot法检测CM肥大基因、CF胶原mRNA和protein的变化,氚标亮氨酸掺入法检测CM蛋白合成速率,免疫细胞化学法检测CM细胞形态学变化。 6.对于TAAC大鼠心肌组织、AngiotensinⅡ刺激后的CM和CF ,用QPCR和western blot法检测GSK3β表达量和活性的变化,以及磷酸化水平的改变。 7.对于转染miR-26 mimics和inhibitor后的CM和CF,用QPCR和western blot法检测GSK3β表达量和活性的变化,以及磷酸化水平的改变。 8.双荧光素酶报告基因系统验证miR-26的靶基因GSK3β。 9.对于CM和CF,转染GSK3β的小分子干扰RNA(siRNA),然后用AngiotensinⅡ刺激细胞,检测GSK3β表达量和活性的变化,以及对CM肥大和CF胶原纤维合成的影响。 10.对于CM和CF,转染GSK3β过表达质粒,检测GSK3β表达量和活性的变化,以及对CM肥大和CF胶原纤维合成的影响。三、结果 1.用TAAC法成功建立大鼠压力过负荷心脏重构模型。 2. TAAC心脏重构大鼠的心肌组织和血浆中miR-26a和miR-26b的水平均较对照组(Sham)下调(P㩳0.05)。 3.用AngiotensinⅡ刺激后,CM和CF细胞中miR-26a和miR-26b的水平均较对照组下调(P㩳0.05)。 4. MiR-26在正常培养的CM中的表达水平明显比在CF中高(P㩳0.05)。 5. CM和CF转染miR-26 mimics后,miR-26a和miR-26b的表达量升高明显(P㩳0.01);CM和CF转染miR-26的inhibitor后,miR-26a和miR-26b的表达量下降(P㩳0.05)。 6.用AngiotensinⅡ刺激转染miR-26 mimics后的CM和CF,肥大基因和胶原表达减少(P㩳0.05),蛋白合成速率减慢(P㩳0.05),细胞表面积缩小(P㩳0.05)。 7. CM和CF转染miR-26 inhibitor后,肥大基因和胶原表达增加(P㩳0.05),P-tau蛋白表达量增加,骨架蛋白α-actin表达增加,蛋白合成速率加快(P㩳0.01),细胞表面积增大(P㩳0.01)。 8. TAAC心脏重构大鼠心肌组织GSK3βmRNA和protein的表达量均增加(P㩳0.05),且伴随GSK3β的活性增强。 9.用AngiotensinⅡ刺激后,CM和CF的GSK3βmRNA表达量均增加(P㩳0.05)。 10. CM和CF转染miR-26 mimics后,GSK3βmRNA和protein的表达量减少(P㩳0.05),而转染miR-26 inhibitor后,GSK3βmRNA和protein的表达量增加(P㩳0.05)。 11.转染miR-26 mimics,能抑制293T细胞中GSK3β3’UTR报告基因载体荧光素酶的表达,使其荧光素酶活性下降(P㩳0.01);转染miR-26 inhibitor,能增加CM和CF细胞中GSK3β3’UTR报告基因载体荧光素酶的表达,使其荧光素酶活性增强(P㩳0.05);证实GSK3β是miR-26的靶基因。 12.用AngiotensinⅡ刺激转染siGSK3β后的CM和CF,肥大基因或COL3的表达量下降(P㩳0.05)。 13. CM和CF转染GSK3β过表达载体后, GSK3βmRNA和protein的表达量增加(P㩳0.05),且GSK3β的活性也增加,伴随肥大基因和胶原的表达量增加。四、结论 1. miR-26在大鼠心脏重构模型中表达下调。 2. miR-26可以通过抑制其靶点GSK3β调控心脏重构过程。
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【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

【引证文献】