猪膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞的体外培养及支架复合物的构建

发布时间：2018-01-11 21:00

  本文关键词：猪膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞的体外培养及支架复合物的构建　出处：《昆明医学院》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分：猪膀胱平滑肌细胞的原代培养及鉴定 [目的]通过探索猪膀胱平滑肌细胞的取材、体外分离、原代培养、扩增、及鉴定的方法,为其作为种子细胞构建组织工程膀胱提供实验依据。 [方法]采用滇南小耳猪,无菌条件下外科手术切取膀胱组织,仔细机械分离膀胱平滑肌层,采用胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ联合消化获取膀胱平滑肌细胞,并以含10%FBS的DMEM/F12培养基进行培养,观察细胞形态变化,生长及增殖过程,用MTT法绘制细胞生长曲线,并通过H-E染色、免疫组织化学染色、透射电镜鉴定细胞。 [结果]体外培养的细胞可融合成片,倒置相差显微镜下观察细胞为长梭形,并表现出典型的“谷和峰”形态,生长曲线测定提示细胞生长状况良好、具有较强增殖能力。通过苏木素—伊红染色符合平滑肌细胞形态特征,平滑肌肌动蛋白染色呈阳性,透射电镜观察符合肌细胞特征。 [结论]运用该方法能够简单易行地在体外培养出大量高纯度的猪膀胱平滑肌细胞并建立了稳定的培养体系；所培养出来的膀胱平滑肌细胞纯度高、活力好可作为构建组织工程膀胱的种子细胞。 第二部分：猪膀胱移行上皮细胞的原代培养及鉴定 [目的]通过探索猪膀胱移行上皮细胞的体外分离、原代培养、扩增、及鉴定的方法,为其作为重要的种子细胞构建组织工程膀胱和尿路上皮组织提供实验依据。 [方法]采用滇南小耳猪,无菌条件下外科手术切取膀胱组织,置于中性蛋白酶中4℃冷消化过夜,仔细剥离得到粘膜组织,低浓度胰酶消化获取高纯度的膀胱移性上皮细胞,并以DK-SFM(含表皮生长因子,胰岛素)培养基中培养,观察细胞形态变化,生长及增殖过程,并通过MTT法测定细胞生长曲线,苏木素-伊红染色,免疫组织化学染色,透射电镜鉴定细胞。 [结果]用该方法消化可以从较少的组织中,获得大量纯度高、活力好的膀胱移性上皮细胞,原代培养的细胞16h后大量贴壁并发生形态改变,通过4-5天培养原代细胞能融合至80%-90%,表现出典型的“铺路石”样结构,传代后细胞能够稳定生长,显微镜下未见杂细胞污染,经过传代后细胞生长加速约3-4天即可传代,细胞6代以前形态规整,H-E染色、透射电镜观察符合上皮细胞特征,免疫组织化学染色呈阳性。 [结论]通过中性蛋白酶过夜冷消化和低浓度胰酶热消化联合应用,经过原代和传代细胞培养,可获得大量纯度高、活力好的移行上皮细胞并建立了稳定的上皮细胞无血清培养体系,为其作为种子细胞构建组织工程膀胱和组织工程尿路上皮提供实验依据。 第三部分：猪膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞与SIS复合物的构建 [目的]观察膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞及两种细胞混合培养在脱细胞小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)上的生长状况,为组织工程膀胱种子细胞和支架材料的进一步研究提供实验依据。 [方法]将猪膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞分别接种到SIS支架材料上复合培养,以及将两种细胞按不同面接种于SIS上复合培养,一周及10天取出细胞-SIS复合物,4%甲醛固定行石蜡切片H-E染色和扫描电镜观察膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞在SIS上的生长状况,以及两种细胞混合培养在SIS上的生长情况。 [结果]石蜡切片H-E染色,扫描电镜观察到SIS有很好的纤维网孔结构,膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞能在SIS上粘附生长、形态良好,混合培养的细胞能在SIS的两个面上有序生长且观察到有部分细胞融合生长。 [结论]膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞能在SIS上粘附生长且细胞形态规整、活力好；SIS能够为膀胱平滑肌细胞和移行上皮细胞的附着、生长以及新陈代谢提供三维空间,是构建组织工程膀胱较为合适的支架材料。
[Abstract]:Part I : Primary Culture and Identification of Porcine Bladder Smooth Muscle Cells Objective : To explore the method of isolating , primary culture , amplification and identification of porcine bladder smooth muscle cells , which provide experimental basis for the construction of tissue engineering bladder as seed cells . Methods Bladder smooth muscle cells were surgically removed under aseptic conditions . Bladder smooth muscle cells were carefully separated by trypsin and collagenase 鈪，

本文编号：1411180