SH-SY5Y细胞内pH值降低对早老素-1表达的影响

发布时间：2018-01-12 08:41

  本文关键词：SH-SY5Y细胞内pH值降低对早老素-1表达的影响　出处：《辽宁医学院》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的 本文旨在研究当细胞内pH值降低时早老素-1的表达变化情况，从而探讨细胞内pH值变化与γ-分泌酶活性的关系。 方法 SH-SY5Y细胞于培养箱中常规培养，其中一部分细胞利用腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE1和腺病毒空载体pAd-miR-NC，按照最佳MOI值感染SH-SY5Y细胞，抑制NHE1基因表达，使细胞内pH值降低，构建细胞内酸化模型和空载体转染组。另一部分细胞用酸化培养基培养，以pH值6.8为基准，依次降低0.5形成6个梯度pH值的培养基，通过计数法绘制生长曲线确定最适细胞生长的酸性培养基，通过降低细胞外环境酸碱度，激活酸敏感离子通道，降低细胞内pH值，构建酸化培养基组。实验以四组细胞进行相应检测，包括正常细胞组、阴性对照组（空载体转染组）、NHE1基因抑制组和酸化培养基组。应用荧光指示剂BCECF/AM，荧光分光光度计记录490nm/440nm荧光强度比值，制备pHi标准曲线，求出各组细胞内pH值。ELISA法定量分析各组细胞内早老素-1的活性，Real-Time PCR检测各组细胞内早老素-1的mRNA表达，Western Blotting检测各组细胞内早老素-1蛋白表达，，分析细胞内pH值变化对早老素-1表达和活性的影响及其与γ-分泌酶的关系。 结果 靶向人NHE1mRNA的腺病毒干扰质粒转染SH-SY5Y细胞，抑制了NHE1表达。正常细胞在不同pH值的培养基培养72小时后，根据细胞生长状态和生长曲线分析选出最适细胞生长的培养基pH值为6.3。应用荧光分光光度计，根据pHi标准曲线求出NHE1抑制组和酸化培养基组的细胞内pH值分别为6.62±0.02和6.99±0.02，较正常细胞组（pHi=7.27±0.02）和阴性对照组（pHi=7.24±0.03）降低，差别有显著性意义（P0.05），而正常细胞组和阴性对照组细胞内pH值无明显变化，差异无显著性意义（P0.05），说明细胞内酸化的SH-SY5Y细胞模型成功建立。ELISA法定量分析各组细胞内早老素-1的活性，NHE1抑制组和酸化培养基组的细胞内早老素-1水平分别为26.3±4.2ng/L和23.5±4.0ng/L，较正常细胞组（9.1±0.6ng/L）和阴性对照组（7.8±1.1ng/L）明显增多，有显著性差异（P0.05）。Real-Time PCR检测各组细胞内早老素-1的mRNA表达，NHE1抑制组和酸化培养基组细胞内的早老素-1基因mRNA相对表达量分别为1.75±0.04和1.39±0.03，较正常细胞组（1.23±0.01）和阴性对照组（1.00）有显著提高（P0.05）。Western Blotting检测各组细胞内早老素-1蛋白表达，NHE1抑制组和酸化培养基组细胞内的PS1蛋白表达分别为0.70±0.01和0.68±0.08，较正常细胞组（0.54±0.01）和阴性对照组（0.55±0.05）有显著差异（P0.05），而NHE1抑制组和酸化培养基组组间比较无明显差异（P0.05），正常细胞组和负对照组组间比较也无明显差异（P0.05）。 结论 细胞内pH值降低可促使早老素-1表达量增加，活性增高。目前认为早老素-1是γ-分泌酶的主要成分和活性中心，因此推测细胞内pH值降低可使γ-分泌酶活性增高，从而导致Aβ生成增多。
[Abstract]:Purpose The purpose of this study was to study the changes of the expression of presenin-1 when the intracellular pH value was decreased, and to explore the relationship between the change of intracellular pH value and the activity of 纬-secretase. Method SH-SY5Y cells were cultured in incubator. Some of the cells were treated with adenovirus interference plasmid pAd-miR-NHE1 and adenovirus empty vector pAd-miR-NC. According to the best MOI value, SH-SY5Y cells were infected, NHE1 gene expression was inhibited, and the intracellular pH value was decreased. The intracellular acidification model and empty vector transfection group were constructed. The other part of the cells were cultured in acidified medium. The other part of the cells were cultured on the basis of pH 6.8 and reduced 0.5 to form 6 gradient pH medium in turn. The growth curve was plotted to determine the most suitable acid medium for cell growth. The pH value of the cells was reduced by reducing the pH value of the cells and activating the acid-sensitive ion channels. Four groups of cells were tested, including normal cells group and negative control group (empty vector transfection group). NHE1 gene inhibition group and acidizing medium group. Fluorescence indicator BCECF / AM and fluorescence spectrophotometer were used to record the fluorescence intensity ratio of 490 nm / 440 nm to prepare the pHi standard curve. The intracellular pH value of each group was calculated. Elisa method was used to quantitatively analyze the activity of intracellular presenin 1 in each group. Real-Time PCR was used to detect the expression of mRNA in the cells of each group. Western. The expression of presenin-1 protein was detected by Blotting. The effect of intracellular pH on the expression and activity of presenin-1 and its relationship with 纬-secretase were analyzed. Results The adenovirus interference plasmid targeting human NHE1mRNA was transfected into SH-SY5Y cells and inhibited the expression of NHE1. The normal cells were cultured in different pH medium for 72 hours. According to the analysis of cell growth state and growth curve, the optimum cell growth medium pH value was 6.3. The fluorescence spectrophotometer was used. According to the pHi standard curve, the intracellular pH values of NHE1 inhibition group and acidified medium group were 6.62 卤0.02 and 6.99 卤0.02, respectively. Compared with normal cell group (7.27 卤0.02) and negative control group (7.24 卤0.03), the difference was significant (P 0.05). However, there was no significant difference in intracellular pH between normal cell group and negative control group (P 0.05). The results showed that the SH-SY5Y cell model of intracellular acidification was successfully established. Elisa was used to quantitatively analyze the activity of intracellular presenin-1 in each group. The intracellular presenin 1 levels in NHE1 inhibition group and acidified medium group were 26.3 卤4.2 ng / L and 23.5 卤4.0 ng / L, respectively. Compared with normal cell group (9.1 卤0.6 ng / L) and negative control group (7.8 卤1.1 ng / L). There was a significant difference in the expression of mRNA of presenin 1 in the cells of each group by P0.05An. Real-Time PCR. The relative expression of mRNA in the cells of NHE1 inhibition group and acidified medium group was 1.75 卤0.04 and 1.39 卤0.03, respectively. Compared with normal cell group (1.23 卤0.01) and negative control group (1.00), it was significantly higher than that of normal cell group (1.23 卤0.01) and negative control group (1.00). Western Blotting was used to detect the expression of presenin 1 protein in the cells of each group. The expression of PS1 protein was 0.70 卤0.01in NHE1 inhibition group and 0.68 卤0.08 in acidified medium group, respectively. There was significant difference between normal cell group (0.54 卤0.01) and negative control group (0.55 卤0.05) (P 0.05). There was no significant difference between NHE1 inhibition group and acidified medium group, and there was no significant difference between normal cell group and negative control group. Conclusion The decrease of intracellular pH value can increase the expression and activity of presenin-1, which is considered to be the main component and active center of 纬-secretory enzyme. It is suggested that the decrease of intracellular pH value can increase the activity of 纬 -secretory enzymes, which leads to the increase of A 尾 production.
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

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本文编号：1413537