微囊藻毒素-LR对中国仓鼠卵巢细胞的氧化应激和凋亡作用

发布时间：2018-01-12 11:13

  本文关键词：微囊藻毒素-LR对中国仓鼠卵巢细胞的氧化应激和凋亡作用　出处：《郑州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是由蓝藻细菌产生的一类单环7肽生物毒素,已发现80多种异构体,其中最常见、研究较深入的是微囊藻毒素-LR(MC-LR). MCs可通过食物链及饮水进入人体,严重威胁人类的生命和健康。 性腺是MCs的第2靶器官,有研究证明MCs具有生殖毒性。但是,目前关于MCs诱导生殖系统尤其是雌性生殖系统损伤方面的资料还不多,其致毒机制也不确定。而有研究发现MC-LR可以在卵中大量存在并传递至后代,而且MC-LR具有环境内分泌干扰作用,能对鱼类和哺乳动物细胞发挥雌激素样作用。因此,研究MC-LR对雌性生殖系统的毒性作用具有重要意义。 本研究以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为模型,经MC-LR暴露后,检测CHO细胞活性的变化,及细胞内活性氧、抗氧化酶、脂质过氧化水平,线粒体膜电位,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性和细胞凋亡率的变化,从分子水平探讨MC-LR对CHO细胞的毒性作用,为阐明MC-LR的生殖毒性作用提供理论基础。 方法： 1.建立传代培养的CHO细胞模型。 2.用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测MC-LR对CHO细胞活性的影响：不同浓度的MC-LR(0μg/ml,1μig/ml,5μg/ml,10μg/ml15μg/ml)处理CHO细胞24h后,用MTT染色,测各组吸光度,计算细胞活性。 3.集落形成实验：用不同浓度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)处理CHO细胞24h,计算各组集落形成能力,评价MC-LR对单个CHO细胞增殖能力的影响。 4.检测MC-LR对CHO细胞中过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的影响：用不同浓度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)处理CHO细胞,24h后收集细胞,用2,7-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)法测定ROS,硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA,可见分光光度法测定CAT。 5.线粒体膜电位检测试剂盒检测不同剂量MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/m1)染毒24h后CHO细胞线粒体膜电位的变化。 6. Caspase-3底物切除法检测MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)对CHO细胞中caspase-3性的影响。 7.膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测不同浓度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后细胞凋亡率的变化。 结果： 1. MC-LR(0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml)处理CHO细胞24h后,MTT法检测结果显示随着毒素浓度升高,细胞形态逐渐改变,细胞活性逐渐降低。且与对照组相比,5μg/ml、10μg/ml和15gg/ml染毒组差异均有统计学意义(P0.05)。集落形成实验中随着染毒浓度增加,集落形成能力下降,与上述结果一致,也证明MC-LR能抑制CHO细胞活性。 2.本次研究发现,MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)作用于CHO细胞24h后,各染毒组的细胞内CAT水平降低,ROS产生和脂质过氧化升高。与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。 3. MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)处理CHO细胞24h后,用线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位,结果显示随着毒素浓度升高,线粒体膜电位降低,存在剂量依赖关系。与对照组相比,各染毒组差异均有统计学意义(P0.05)。 4.随着染毒浓度增大,细胞中caspase-3(?)(?)性剂量依赖性增强。且与对照组相比,各浓度MC-LR染毒组的差异均有统计学意义(P0.05)。 5.流式细胞仪检测发现,MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)处理CHO细胞24h后,各染毒组细胞凋亡率随着毒素浓度的升高而升高,且差异均有统计学意义(P0.05)。 结论： 1.暴露于MC-LR能诱导体外培养的CHO细胞发生氧化应激。 2.诱导氧化损伤后,MC-LR导致进一步的毒性作用,抑制CHO细胞活性,并可能通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡,对雌鼠具有生殖毒性作用。
[Abstract]:Microcystins (Microcystins, MCs) is produced by cyanobacteria, a single ring of 7 peptide biological toxins, has found 80 kinds of isomers, the most common one, in-depth study is of microcystin -LR (MC-LR). MCs can enter the body through the food chain and water, a serious threat to human life and health.
The gonad is second target organ of MCs, studies have proved that MCs has reproductive toxicity. However, researches on the MCs induced reproductive system especially in female reproductive system. The data is more, its toxic mechanism is uncertain. But studies have found that MC-LR can exist in the egg and transmitted to the offspring, but also has environmental endocrine disrupting effects of MC-LR, can exert estrogenic effects on fish and mammalian cells. It has important significance to study the toxic effects of MC-LR on female reproductive system.
In this study, Chinese hamster ovary (CHO) cells as a model, after exposure to MC-LR, to detect the changes of the activity of CHO cells, and the intracellular reactive oxygen species, antioxidant enzymes, lipid peroxidation, mitochondrial membrane potential, aspartate specific cysteine protease -3 (Caspase-3) activity and apoptosis rate, to investigate the toxicity effect of MC-LR on CHO cells at the molecular level and provide a theoretical basis for the reproductive toxicity of MC-LR is clarified.
Method锛，

本文编号：1414005