肺炎链球菌DHBPs的结构和功能研究

发布时间：2018-01-12 23:05

  本文关键词：肺炎链球菌DHBPs的结构和功能研究　出处：《重庆医科大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的 核黄素(riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前体物[1,2,3],对生物体的生物合成至关重要。研究发现许多革兰阳性细菌(如肺炎链球菌,S.pneumoniae)、阴性细菌(如鼠伤寒沙门,Salmonella typhimurium)和真菌(白假丝酵母,Candida albicans)等如果不能够从外界摄取足够的黄素(flavin)就需要自身合成核黄素(vitamin B12,riboflavin)以维持菌体的生存与增殖[4,5,6]。 DHBPs (3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase),3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶,为核黄素生物合成关键酶之一[7]。在镁离子存在的情况下DHBPs将5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate,Ru5P)分解为3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate,DHBP)和甲酸(formate)。生成的DHBP为核黄素合成的必需的原料之一[2]。因此如果能够抑制DHBPs的活性,就可能阻断细菌的核黄素的合成,进而抑制细菌的生存和增殖。 人类没有合成核黄素的相关的酶而直接从食物中获得以维持生存需要。因此细菌参与生物合成核黄素的相关酶就成为抗菌药物作用的靶位点,其三维结构的获得将有为设计开发新一代抗菌药物提供重要的结构模型[7,8]。因此DHBPs可望成为新一代抗生素作用的靶蛋白质。 针对世界肺炎链球菌的耐药越来越严重的问题,开发创新型基于结构的抗生素迫在眉睫。本课题通过对肺炎链球菌来源的DHBPs的结构的解析,目的是为潜在的新型抗生素或者疫苗提供理论依据。 方法 克隆、表达、纯化DHBPs蛋白质并利用汽相扩散法结晶获得肺炎链球菌DHBPs的晶体,使用house X射线光源(转靶)收集分辨率较好的衍射数据;以Protein Data Bank(PDB)中以Candida albicans的DHBPs(PDB code 10.2210)的A链第1-200位氨基酸残基作为模型,利用分子置换法(Molecular Replacement,MR)以获得DHBPs晶体三维空间结构模型。 结果 收到一套分辨率2.21-2.20?的数据,用分子置换法解析出DJHBPs三维结构,并对其修正。修正后DHBPs的三维空间结构(Rfactor =5.5 %,Rfree=34.5%,PDB code)。通过结构分析发现:DHBPs与已知的其它物种来源的DHBPs分子结构相似,为进化上结构比较保守的蛋白质。利用凝胶层析实验本研究证实:DHBPs在溶液中为二聚体形式和单体两种形式存在,与晶体中两个单体结合成二聚体的分子堆积方式是相符合的;通过蛋白质结构、序列分析发现:底物作用位点位于DHBPs二聚体的结合位点,多个氨基酸参与,包括:Arg 139、Thr143和His142等直接参与了与Ru5P的磷酸基团的结合;Glu30、Asp32、Cys57、Glu163、Thr96(B分子)、His125(B分子)和Asp90(B分子)等直接参与了与Ru5P核酮糖基团的结合,而Leu55和Phe85提供了酶与底物的结合疏水环境,为基于三维结构的新型抗生素的研究提供理论依据。
[Abstract]:objective
Riboflavin (riboflavin) is a cofactor flavin adenine dinucleotide (flavin adenine dinucleotide FAD (Flavin) and flavin mononucleotide mononucleotide, FMN) the precursor of [1,2,3] biosynthesis is essential to organisms. The study found that many gram positive bacteria (such as Streptococcus pneumoniae, S.pneumoniae), negative bacteria (such as typhoid Salmonella, Salmonella and typhimurium) fungi (Candida albicans, Candida albicans), if not from the outside adequate intake of flavin (Flavin) requires the synthesis of riboflavin (vitamin B12, riboflavin) in order to maintain the survival and proliferation of [4,5,6]. cells
DHBPs (3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase), 3,4- -2- two hydroxy butanone -4- phosphate synthase, is one of the key enzymes in the biosynthesis of riboflavin [7]. magnesium ion in the presence of DHBPs 5- ribulose phosphate (ribulose-5-phosphate, Ru5P) - based -2- decomposition for 3,4- (3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate, DHBP -4- butanone phosphate) and benzoic acid (formate) generated by DHBP. As one of the necessary ingredients of riboflavin synthesis [2]. so to inhibit the activity of DHBPs, the synthesis may block the bacterial riboflavin, thereby inhibiting the survival and proliferation of bacteria.
No human enzyme involved in the synthesis of riboflavin and to maintain the survival needs directly from food. So the enzymes involved in the biosynthesis of riboflavin bacteria has become the target sites of antibacterial drug, its three-dimensional structure can be designed for the development of a new generation of antibacterial drugs provide important structural model [7,8]. so DHBPs is expected to become a new target protein a generation of antibiotics.
In view of the increasingly serious drug resistance of Streptococcus pneumoniae in the world, the development of innovative structure based antibiotics is imminent. The purpose of this study is to provide a theoretical basis for potential new antibiotics or vaccines by analyzing the structure of DHBPs from Streptococcus pneumoniae.
Method
Cloning, expression and purification of DHBPs protein and DHBPs of Streptococcus pneumoniae by vapor diffusion method using house crystal crystal X ray source (rotating target) better resolution of the diffraction data collection; with Protein Data Bank (PDB) in Candida albicans DHBPs (PDB code 10.2210) A chain 1-200 amino acid residues as a model, using the molecular replacement method (Molecular Replacement MR) to obtain DHBPs crystal three-dimensional space structure model.
Result
Received a set of resolution 2.21-2.20? Data, parse out the DJHBPs three-dimensional structure by molecular replacement method, and the correction. Three dimensional structure of modified DHBPs (Rfactor =5.5 Rfree=34.5%, PDB%, code). The structure analysis shows that the molecular structure of DHBPs and DHBPs from other species known as evolutionary structure similar. Comparison of conserved proteins by gel chromatography experiment. This study proved that DHBPs in solution for the existence of two polymer monomer and two types, and two single crystal with two molecular dimer packing is consistent; through the protein structure, sequence analysis showed: the substrate site located in DHBPs poly two binding sites of the amino acids involved, including: Arg 139, Thr143 and His142 were directly involved in the binding of phosphate groups of Ru5P; Glu30, Asp32, Cys57, Glu163, Thr96 (B), His125 (B) and Asp90 ( B molecules were directly involved in the binding of Ru5P to the nucleose group, while Leu55 and Phe85 provided the hydrophobic environment of enzyme and substrate, providing a theoretical basis for the research of new antibiotics based on three-dimensional structure.

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

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