循环牵张应力对大鼠许旺细胞增殖与表达的影响

发布时间：2018-01-19 08:29

  本文关键词： 许旺细胞 生物力学 骨延长术 周围神经 细胞增殖 基因表达谱　出处：《天津医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：通过体外构建许旺细胞循环牵张力学模型,对体外培养的许旺细胞实施循环牵张应力刺激模拟载体神经的缓慢牵张,探索循环牵张应变刺激对周围神经来源许旺细胞增殖以及mRNA表达的影响,从细胞生物力学以及分子生物学角度探讨肢体延长中的神经生长延长机制。 方法： 1.体外平面循环牵张应力加载模型的建立：将硅橡胶材料制作成0.1cm厚的透明薄膜,结合硅橡胶材料的泊松比以及弹性模量,应用三维有限元分析软件对数据进行处理,模拟硅橡胶受到牵张应变后产生的形变；通过MTT方法比较细胞在硅橡胶和标准培养板上的生长情况,并采取体外皮下包埋实验验证硅橡胶材料是否具有生物学毒性。 2.许旺细胞的纯化：分离新生6d的Wista大鼠双侧坐骨神经,双酶消化法分离许旺细胞,用S-100免疫细胞化学染色方法对许旺细胞进行鉴定。将收集到的细胞分为3组,分别应用冷喷注法、改良冷喷注法和酶消化法对细胞进行纯化,纯化后的细胞分别计算纯度,流式细胞仪测定细胞活性,并从细胞纯度、细胞活性、纯化后所得细胞数量三个方面对许旺细胞的纯化方法进行评估,从而寻找最佳的许旺细胞纯化方法。 3.循环牵张应变刺激加载：体外培养6d龄大鼠许旺细胞并传至P3代,按照刺激强度分为0、5%和10%形变组,利用ElectroForce3200力学试验仪搭载的BioDynamic生物反应舱系统,以6h为固定时间点对细胞进行频率为0.25Hz的周期性牵张应力刺激。观察细胞形态学变化,流式细胞术检测不同应力刺激下许旺细胞的增殖率,获得许旺细胞增殖的最佳应力值,并分为无力学刺激组和力学刺激组2组。Trizol分别提取细胞mRNA,采用高通量技术分析实验组与对照组细胞基因表达谱差异,并采用聚类分析、GO分析等对实验结果进行分析整理。 结果： 1.本课题组自制的硅橡胶细胞载体表面应力分布均匀,有效应变面积分布大,生物学相容性尚可,在BioDynamic细胞应力加载系统的配合下,可满足许旺细胞的牵张刺激的实验。 2.相比冷喷注法和差速酶消化两种方法而言,改良冷喷注法提纯许旺细胞存在操作简便,获得许旺细胞纯度高、不影响细胞活性等优点,缺点是对操作者实验操作技术和经验要求相对较高,初学者不易掌握,需在多次实践中摸索掌握,但不失为一种可供参考的许旺细胞纯化新方法,适合在本实验中继续使用。 3.在5%的应变刺激下,许旺细胞的S期细胞比例和增殖指数(PI)相比无应变刺激时有所升高,然而15%的应变刺激下,两指标同时降低；光学显微镜下可见许旺细胞表现出明显的形态学变化。比较实验组与对照组基因表达谱,上调基因894个,下调基因1570个 结论：许旺细胞的增殖情况与所加载力的大小呈现一定的剂量相关性；适当大小的牵张应力通过某种机制作用于周围神经的许旺细胞并促进其增殖,同时,牵张应力可以改变许旺细胞多种基因的表达以及对许旺细胞的生命活动进行一系列的调控,这些基因有可能与轴突的生长存在密切的联系。
[Abstract]:Objective: to construct the Schwann cell cycle stretch mechanical model in vitro of cultured Schwann cells circulating lead Zhang Yingli nerve stimulation carrier slow distraction, exploration of cyclic stretching stimulation on peripheral nerve derived Schwann cells proliferation and mRNA expression of the influence of nerve growth in limb lengthening extension mechanism from the perspective of molecular biology and cell biomechanics.
Method锛，

本文编号：1443433