Rhbdd3分子在免疫应答调控中的作用及其机制研究

发布时间：2018-01-20 20:50

本文关键词： Rhbdd3 NK细胞 TLR3 DAP12 急性肝损伤 Rhbdd3 NEMO TLR4 NF-κB A20　出处：《第二军医大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分Rhbdd3分子抑制TLR3介导的NK细胞活化及其机制研究天然免疫应答在机体抵抗病原体侵袭过程中发挥重要作用。NK细胞是一种重要的天然免疫细胞，通过释放多种细胞因子及杀伤性物质介导免疫活化和免疫监视，在机体抵抗感染和肿瘤发生过程中发挥关键作用。随着近年来对天然免疫应答中模式识别机制的认识不断深入，发现NK细胞也表达多种TLR，尤其是与T细胞、B细胞、单核细胞相比表达更高水平的TLR3。已证实，当TLR3与其配体poly (I:C)相互作用后能以直接或间接的方式诱导NK细胞活化。大量研究表明NK细胞功能紊乱参与了多种炎症性疾病及自身免疫性疾病的病理过程。TLR3触发的NK细胞活化在肝脏炎症与损伤中发挥关键作用。因此，NK细胞活化受到免疫系统的精密调控，然而目前关于NK细胞功能负向调控机制的研究却并不深入。机体在生理情况下如何控制NK细胞不被过度活化以维持免疫稳态、避免免疫病理损伤的发生？是否存在新型的调控蛋白参与控制TLR3或其他信号介导的NK细胞活化？这些新型调控蛋白通过何种分子机制影响NK细胞活化，是否需要其他免疫细胞或免疫分子的参与？对这些科学问题的回答不但有助于深入了解NK细胞如何受到严格调节以维持生理条件下的免疫稳态，而且为NK细胞过度活化引发的相关疾病的控制提供潜在的药物靶点。 Rhbdd3分子属于一类含有Rhomboid结构域的蛋白家族，早期被称为垂体瘤凋亡基因（pituitary tumor apoptosis gene，PTAG）。本人在硕士课题研究中发现Rhbdd3分子能够通过控制DC成熟及抑制TLR触发的NF-κB信号通路活化，抑制IL-6等炎症因子的释放，维持体内Treg与Th1和Th17的平衡，进而在整体水平上抑制自身免疫性疾病的发生。本课题中，我们研究了Rhbdd3分子是否在TLR3介导的NK细胞活化过程中也具有调控作用，并进一步研究了其信号转导机制及其对NK细胞介导的TLR3触发的急性肝损伤的抑制作用。 1. Rhbdd3分子负向调节TLR3触发的NK细胞活化首先，我们从体内外2个方面，研究Rhbdd3分子是否对NK细胞活化具有调控作用。体外实验发现，Rhbdd3~(-/-)小鼠来源的脾脏细胞在poly (I:C)刺激后比野生型对照组分泌更高水平的IFN-γ和IL-6，而在IL-12和IL-15刺激后分泌的IFN-γ和IL-6水平与对照组相似；进一步发现，在poly (I:C)刺激后Rhbdd3~(-/-)小鼠脾脏细胞中NK1.1+细胞表达的胞内granzyme B、perforin及IFN-γ水平比野生型对照组明显增高，而IL-12和IL-15刺激后的表达水平与对照组相似，提示Rhbdd3分子能特异性调控TLR3介导的NK细胞活化。在体内实验中，分别给予Rhbdd3~(-/-)和野生型小鼠体内poly (I:C)处理后，发现Rhbdd3~(-/-)小鼠肝脏中的NK细胞募集比野生型小鼠明显增多，且肝脏NK1.1~+NK细胞的胞内granzyme B、perforin及IFN-γ表达水平及对NK细胞杀伤作用敏感的YAC-1肿瘤细胞的杀伤活性均比野生型明显增强。综合上述体内外研究结果，表明Rhbdd3分子能够负向调控TLR3触发的脾脏及肝脏中NK细胞的活化，并抑制NK细胞在病理情况下在肝脏的募集。 2. Rhbdd3分子负向调控TLR3触发的NK细胞活化的机制（1）Rhbdd3分子抑制TLR3激活NK细胞依赖于NK细胞与其他细胞的相互接触为了探讨Rhbdd3分子负向调控TLR3触发的NK细胞活化的机制，我们首先分离了DX5~+脾脏NK细胞，发现在DX5~+NK细胞单独存在的情况下，无论Rhbdd3-/-小鼠还是野生型小鼠来源的DX5~+NK细胞在poly (I:C)刺激后都分泌相似低水平的IFN-γ，而无论有无poly (I:C)刺激，Rhbdd3~(-/-)小鼠NK细胞杀伤活性均比野生型明显增强。考虑到在没有其他支持因素存在的情况下，单纯NK细胞在体外培养条件下极易凋亡，我们在培养体系中加入IL-12和IL-15来支持NK细胞的生存。结果发现在IL-12和IL-15支持下，小鼠DX5~+NK细胞在poly (I:C)后分泌极高水平的IFN-γ；但是比较Rhbdd3-/-小鼠与野生型小鼠来源的DX5~+NK细胞，无论poly (I:C)刺激与否，都分泌同等高水平的IFN-γ。以上结果表明，在IL-12和IL-15存在的情况下，单独存在的NK细胞在TLR3配体刺激后能够发生明显的活化，但Rhbdd3分子不能够直接调控TLR3诱导的NK细胞活化，需要其他因素的存在。由于脾脏包含多种细胞类型，于是我们推测是否其他细胞参与了Rhbdd3分子对TLR3触发NK细胞活化的调控作用。首先，我们通过transwell共培养体系阻断脾脏细胞中DX5~+NK细胞与余下的DX5~-细胞的相互接触，发现在poly (I:C)诱导下脾脏细胞分泌的IFN-γ及NK1.1~+细胞上表达granzyme B的水平与未分隔的体系相比均明显下降，表明在NK与其他细胞相互接触的情况下，TLR3配体才能够最佳地诱导NK活化。且在这种Transwell分隔体系下，TLR3配体刺激后，Rhbdd3~(-/-)和野生型小鼠脾细胞分泌的IFN-γ及NK1.1~+细胞上表达granzyme B的水平没有明显差异。因此，Rhbdd3分子负向调控TLR3介导的NK细胞活化依赖于NK细胞与其他细胞的相互接触。（2）Rhbdd3分子抑制TLR3激活NK细胞依赖于NK细胞与DC或Kupffer细胞的相互接触已有文献报道，NK细胞与DC能以细胞间相互接触依赖的方式相互调节。我们的前期研究已经证实Rhbdd3分子能够负向调控TLR触发的树突状细胞活化，于是我们推测DC等抗原提呈细胞可能是Rhbdd3分子负向调控TLR3介导的NK细胞活化过程中所依赖的细胞类型。此外，由于TLR3信号的过度活化是诱导肝脏炎症与损伤的一种致病机制，因此我们选取了2种抗原提呈细胞，骨髓来源DC和肝脏Kupffer巨噬细胞（KC），研究是否这些细胞的存在参与了Rhbdd3分子负向调控TLR3介导的NK细胞活化。我们将Rhbdd3~(-/-)小鼠或野生型小鼠来源的NK细胞分别与这两种小鼠的骨髓来源DC或肝脏KC以不同组合共同培养，包括：WT NK~+WT DC（或KC）；WT NK~+Rhbdd3~(-/-)DC（或KC）；Rhbdd3~(-/-)NK~+WT DC（或KC）；Rhbdd3~(-/-)NK~+Rhbdd3~(-/-)DC（或KC），并同时给予poly (I:C)刺激。我们发现在与同一种基因型的DC或Kupffer细胞相互作用下，poly (I:C)能够刺激Rhbdd3~(-/-)小鼠来源的NK细胞分泌比野生型NK细胞更高水平的IFN-γ，其中Rhbdd3~(-/-)NK1.1~+细胞胞内IIFN-γ和granzyme B表达水平也显著高于野生型NK细胞。此外，Rhbdd3~(-/-)DC比野生型DC更有效促进poly(I:C)诱导的同一种NK细胞的活化，进一步证实了以前的研究中Rhbdd3对TLR3触发的DC成熟的负向调控作用。以上结果表明，DC及Kupffer细胞参与了Rhbdd3分子对TLR3触发的NK细胞活化的负向调控作用。（3）Rhbdd3分子通过抑制DAP12表达而抑制TLR3触发的NK细胞活化我们接下来深入研究了Rhbdd3分子负向调节TLR3介导的NK细胞活化的分子机制。首先我们检测了Rhbdd3分子在TLR3刺激NK细胞前后的表达，发现在体内给予poly (I:C)处理或者体外用poly (I:C)刺激全脾细胞后，脾脏中NK细胞表达Rhbdd3分子的水平明显增高，而在IL-12/15刺激下NK细胞表达Rhbdd3分子没有变化，表明TLR3信号能够上调NK细胞表达Rhbdd3分子。除了TLR信号能够活化NK细胞，NK细胞的活化还取决于其细胞表面的NK细胞活化型受体和抑制型受体介导信号的强弱，因此我们检测了是否Rhbdd3分子参与调节NK细胞表面这些受体的表达水平，然而结果显示NK细胞表达这些受体不受Rhbdd3分子影响。 DAP12蛋白是与NK细胞活化受体相连的一种adaptor蛋白，对传递活化信号至关重要。虽然NK细胞表达活化受体不受Rhbdd3分子影响，但我们发现用干扰RNA阻断野生型NK细胞中Rhbdd3分子的表达后，DAP12在蛋白水平明显增强而在mRNA水平没有明显的差异，提示Rhbdd3分子可能在翻译或翻译后水平调控DAP12的表达。通过confocal显微镜，我们观察到NK细胞中Rhbdd3分子在poly (I:C)刺激后与DAP12相互靠近而产生共定位。这些结果提示TLR3活化后，Rhbdd3分子能与DAP12相互作用并负向调控DAP12表达，从而实现负向调控NK细胞活化。我们进一步研究了在poly (I:C)刺激下，Rhbdd3~(-/-)来源NK细胞在与DC共培养后胞内MAPK信号的活化情况，发现p-ERK、p-JNK及p-p38水平与野生型NK细胞相比明显增高。同样，体内实验结果表明，给予poly (I:C)刺激后，Rhbdd3~(-/-)来源小鼠的脾脏NK细胞p-ERK、p-JNK及p-p38活化水平比对照组明显增高，而NF-κB通路无明显差异。综上表明，NK细胞在体内受到TLR3信号刺激后上调Rhbdd3分子的表达，而Rhbdd3分子通过抑制DAP12的表达并控制下游MAPK的活化反馈性抑制TLR3介导的NK细胞活化。 3. Rhbdd3分子通过控制NK细胞活化而抑制TLR3诱导的急性肝损伤鉴于NK细胞是TLR3诱导急性肝损伤的主要效应细胞，在上述研究基础上，我们从整体角度进一步研究了Rhbdd3分子是否在TLR3触发的肝损伤中具有保护作用。我们发现，体内给予poly (I:C)刺激后，Rhbdd3~(-/-)小鼠血清中ALT、AST、IFN-γ及IL-6水平比野生型对照组明显增高，肝脏病理显示肝脏中炎性细胞浸润及肝组织坏死也比对照组明显增强，提示Rhbdd3分子能有效保护TLR3触发的急性肝损伤。进一步，我们发现，用抗NK1.1单克隆抗体清除体内NK细胞可有效保护Rhbdd3~(-/-)及野生型小鼠在poly (I:C)注射后发生的急性肝损伤；在此基础上，过继回输NK细胞后可恢复NK细胞清除的小鼠对poly (I:C)诱导急性肝损伤的敏感性，而回输Rhbdd3~(-/-)NK细胞比回输野生型NK细胞能导致NK细胞清除小鼠在poly (I:C)注射后发生更为严重的肝脏损伤。上述结果证实Rhbdd3分子通过控制NK细胞活化从而减弱TLR3触发的急性肝损伤的发生。综上，通过本课题的研究我们得出如下结论：TLR3活化剂进入机体后诱导NK细胞活化并上调Rhbdd3分子的表达。在NK细胞与其他细胞相互作用的过程中，Rhbdd3分子通过下调NK细胞中DAP12表达而抑制NK细胞在与其他细胞相互作用中获得的活化信号，并抑制其下游MAPK通路活化；另一方面，Rhbdd3分子还能抑制NK细胞向肝脏的募集及NK细胞与肝脏Kupffer细胞的相互作用，最终达到控制TLR3触发的急性肝脏损伤的作用。本研究首次发现了Rhbdd3对NK细胞活化的负向调控功能并阐明了其分子机制，揭示了机体在天然免疫应答过程中如何实现免疫自稳的新型调控机制，为NK细胞相关的急性炎症损伤的控制提供了可能的靶点。第二部分Rhbdd3分子负向调控TLR诱导树突状细胞活化的机制研究树突状细胞（Dendritic cells，DC）是机体功能最强大的专职抗原提呈细胞，通过模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）识别病原体表达的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），在炎症反应、天然免疫应答以及后续激活适应性免疫应答中发挥关键作用。树突状细胞活化的调控机制的研究对于感染、肿瘤及自身免疫性疾病等疾病的治疗策略研究以及疫苗的设计研发都具有重要意义。作为研究最为广泛的一类PRRs，TLRs表达于DC等天然免疫细胞，其介导的信号通路能够诱导DC成熟和活化。其中TLR4可以通过Myd88依赖和非依赖方式最终激活转录因子NF-κB；在Myd88依赖途径中，TLR4通过招募Myd88而活化IRAK1和IRAK4激酶，进而招募并结合TRAF6，促进TRAF6和NEMO发生K63多聚泛素化。K63多聚泛素链的形成激活下游TAK1复合体，并激活IKK复合体进而促进IκB磷酸化并与NF-κB解离，释放NF-κB入核，诱导炎性细胞因子产生。对于TLR如何激活下游信号通路促进NF-κB活化已有较清楚认识，然而对于TLR介导的NF-κB活化过程是如何受到调控的研究并不深入。蛋白质分子的泛素化是调控细胞内信号转导的一个重要分子机制。在诱导NF-κB活化的信号通路中，NEMO分子通过泛素连接（NEMO-ubiquitin binding，NUB）结构域连接K63多聚泛素链，与TAB2/3共同促进NF-κB活化。虽然NEMO泛素化在TLR信号活化中发挥的关键作用得到深入研究，然而其具体分子机制，特别是NEMO泛素化如何受到调节以及NEMO泛素位点与泛素链的相互关系尚不十分清楚。对于机体如何调控TLR4介导的NF-κB活化，特别是NEMO泛素化对NF-κB活化的调节作用的具体分子机制的研究将有助于深入认识天然免疫应答的活化与调控机制，为免疫相关疾病的预防与控制提供了新的研究思路。本人在硕士课题研究中发现Rhbdd3分子通过其UBA结构域与NEMO相互作用抑制TLR4诱导的NF-κB活化，抑制TLR触发的DC成熟和炎性因子的产生，进而控制Th17及Treg分化的平衡及自身免疫性疾病的发生发展。本课题中我们深入研究了Rhbdd3分子如何影响TLR4诱导NF-κB活化的分子机制。 1. Rhbdd3分子通过UBA结构域与NEMO蛋白K302位点连接的K27位多聚泛素链相互作用，进而抑制NF-κB活化本人在硕士期间的研究表明，Rhbdd3~(-/-)小鼠来源BMDC在LPS刺激后与野生型BMDC相比NF-κB活化明显增强，而过表达Rhbdd3能显著抑制TNF-α或LPS诱导的NF-κB的活化。通过转染突变的Rhbdd3分子和免疫共沉淀实验，我们证实Rhbdd3分子通过其UBA结构域与NEMO分子发生相互作用。在本课题中，我们进一步对NEMO中与Rhbdd3分子相互作用的关键性位点进行了寻找。我们对NEMO中可能发生泛素化的保守位点进行了突变，构建了一系列携带不同突变位点的NEMO表达质粒。通过将突变的Rhbdd3分子和NEMO分子共转染细胞及免疫共沉淀实验，我们发现，K302位点是NEMO蛋白上与Rhbdd3分子相互作用的关键位点。虽然很多证据表明泛素分子中K48的多聚泛素化链的形成主要介导发生泛素化信号分子的降解作用，而K63位的多聚泛素链主要介导信号分子的定位和活化作用，泛素中其他位点发生的多聚泛素链对信号分子的作用目前罕有报道。我们对泛素分子中的不同赖氨酸位点分别进行了点突变，构建了一系列携带突变泛素分子基因的表达质粒，每个质粒中只保留了1个正常Lys位点，结果发现突变泛素中K27位点的质粒可完全消除Rhbdd3分子与NEMO蛋白的相互作用。可见，Rhbdd3分子依赖其UBA结构域与NEMO蛋白K302位点连接的K27多聚泛素链相互作用，进而抑制TLR4诱导的NF-κB活化。 2. Rhbdd3分子促进A20介导的NEMO K278/K392位点发生K63位去泛素化，进而抑制TLR诱导的NF-κB活化（1）Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K278和K392位点发生K63多聚泛素化接下来，我们进一步研究了Rhbdd3分子与NEMO相互作用后如何调控NF-κB活化。NEMO蛋白的K63位多聚泛素化是TLR诱导IKK复合体活化的关键步骤。我们发现，Rhbdd3~(-/-)BMDC的K63泛素化水平明显高于对照组DC，且过表达Rhbdd3分子能抑制NEMO的K63多聚泛素化，表明Rhbdd3分子参与控制NEMO的K63多聚泛素化；此外，NEMO分子上K278和K392位点突变可显著抑制NEMO蛋白结合K63泛素链，表明NEMO的K63多聚泛素链主要结合在NEMO的K278和K392位点。因此，Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K278位和K392位发生K63的多聚泛素化。（2）Rhbdd3分子招募并与A20结合从而促进A20与NEMO的相互作用上述研究表明Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K63多聚泛素化。已有文献报道A20通过去泛素化NEMO上连接的K63位多聚泛素链抑制TLR诱导的NF-κB活化。于是我们进一步研究是否A20在Rhbdd3分子负向调控NEMO的K63泛素化中发挥作用。我们通过免疫共沉淀实验发现Rhbdd3-/-DC在LPS诱导后Rhbdd3分子和A20的结合比对照组显著减弱；过表达全长Rhbdd3能同时结合NEMO和A20，，并促进A20与NEMO的相互结合；缺失189-321序列的Rhbdd3突变体则不具有此效应。综上表明，Rhbdd3分子通过其189-321位未知保守序列招募并与A20相互作用，促进A20与NEMO的结合，从而促进A20对NEMO的K63位多聚泛素链的降解作用，实现控制NF-κB活化。综上，本研究发现了Rhbdd3分子控制TLR诱导NF-κB活化的分子机制，即Rhbdd3通过其UBA结构域与NEMO K302位点的K27多聚泛素链相互作用，并通过其189-321位未知保守序列招募A20并与A20分子相互作用，促进A20介导的NEMO蛋白K278/K392位点连接的K63位泛素链去泛素化，进而抑制NF-κB活化。本课题首次揭示了Rhbdd3负向调控TLR/NEMO/NF-κB信号通路的分子机制，丰富了对蛋白泛素化调控的分子机制的认识。我们对Rhbdd3的免疫学功能与作用机制的研究不但有助于解释与NF-κB过度活化相关的炎症性疾病的发生机制，也有可能成为一个药物靶点用于炎症性、自身免疫性疾病或者免疫缺陷病等疾病的治疗。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【共引文献】