ROCK表达下调对PDGF介导的血管平滑肌细胞迁移、增殖的调控

发布时间：2018-01-22 07:21

  本文关键词： ROCK MAPK PDGF 血管平滑肌细胞 细胞迁移 细胞增殖　出处：《大连医科大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:血管平滑肌细(vascular smooth muscle cell, VSMC)从中膜向内膜下间隙的迁移和过度增生是高血压、血管成形术后再狭窄和动脉粥样硬化等疾病发生及发展过程中的关键环节之一。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)为一种较强的促有丝分裂剂,且具有趋化活性,其靶细胞主要是VSMC。PDGF-BB亚型是现已知VSMC最强体外趋化剂,介导VSMC迁移及增殖。影响VSMC迁移与增殖的信号转导通路很多,其中Rho/ROCK信号转导通路中的ROCK通过影响下游蛋白分子磷酸化水平,以及调节细胞周期蛋白的表达,从而影响VSMC的迁移和增殖。ROCK有2种亚型,分别为ROCKⅠ和ROCKⅡ,二者氨基酸序列的同源性为65%,激酶区同源性则高达92%。因此,一般学者认为二者在细胞内功能相同。随着研究的深入发现,在某些细胞中ROCKⅠ和ROCKⅡ具有不同细胞功能。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)为转导细胞外信号到胞内,影响细胞增殖和迁移等生物学行为的一类重要信号系统。现已知真核细胞中主要的MAPK通路包括JNK通路,ERK1/2通路,p38 MAPK通路及ERK5通路。新近研究表明p38 MAPK参与活体动物血管损伤后的动脉再狭窄过程,且ERK1/2通路与细胞迁移和增殖密切相关。两者在血管损伤后的动脉再狭窄过程中具有协同作用。目前,ROCK两种亚型在VSMC的迁移和增殖中的作用是否一致尚不清楚。本课题旨在研究ROCK亚型(ROCKⅠ与ROCKⅡ)在大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)迁移和增殖中的作用及其分子机制。 方法:(1)利用siRNA干扰技术,通过脂质体转染ROCKⅠ和ROCKⅡ的siRNA,使ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表达分别下调,检测基因表达下调后蛋白的表达水平。(2)利用免疫印迹法(Western blot)检测MAPK通路相关蛋白的磷酸化水平及细胞周期相关因子的表达。(3)利用Boyden Chamber法,观察ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表达下调后以及ROCK特异抑制剂Y-27632对PDGF诱导的A7r5细胞迁移的影响。(4)利用MTT方法检测细胞增殖情况。(5)利用细胞流式分析技术,通过PI染色法分析各实验组在PDGF诱导下的细胞周期的变化。 结果:(1)siRNA转染细胞后ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表达明显下调,且加入PDGF后不影响siRNA下调蛋白表达的效率。(2)ROCKⅠ表达下调和抑制剂Y27632,均抑制由PDGF诱导的A7r5细胞的迁移,而ROCKⅡ表达下调后的抑制作用不明显。(3)在胞浆中,ROCKⅠ和ROCKⅡ表达下调及Y27632处理后,PDGF介导的Erk1/2磷酸化水平无明显变化; ROCKⅠ表达下调及Y27632处理组,p-p38水平无变化,而随着ROCKⅡ表达下调,p-p38水平却有增加趋势。(4)在核提取物中,下调ROCKⅠ和ROCKⅡ表达或Y27632及PD98059处理组的p-ERK1/2水平均降低;(5)ROCK亚型表达下调以及抑制剂Y27632均能抑制由PDGF介导的细胞增殖;(6)ROCK亚型表达下调及抑制剂Y27632可能会抑制由PDGF引起的细胞周期G1/S期的转化;(7)ROCKⅠ和ROCKⅡ表达下调及抑制剂Y27632使cyclinD1,PCNA,CDK4等细胞周期相关蛋白表达降低。 结论:(1)ROCK两种亚型中,ROCKⅠ在VSMCs的迁移中起主导作用,ROCKⅡ对迁移的影响不明显;(2)ROCKⅠ可以调控p-Erk1/2由胞质向细胞核内的移位过程,而ROCKⅡ能在胞浆中调节p38的磷酸化水平,ROCK可能是MAPK信号通路的上游调控因子之一;(3)ROCK亚型均参与调控由PDGF介导的血管平滑肌细胞的增殖。
[Abstract]:Objective : To investigate the role of p38 MAPK in the migration and proliferation of cultured vascular smooth muscle cells ( VCLs ) , which is one of the key links in the pathogenesis and development of vascular smooth muscle cell , vascular smooth muscle cell and vascular smooth muscle cells . Methods : ( 1 ) Using siRNA interference technique , the siRNA of ROCK 鈪，

本文编号：1454065