中缅边境恶性疟原虫的态型研究

发布时间：2018-01-23 15:00

  本文关键词： 恶性疟 基因分型 混合株 MSP1 MSP2 GLURP RT-PCR　出处：《昆明医学院》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：使用体外培养和分子生物学方法,了解云南省中缅边境地区恶性疟原虫基因分型的分布特点,以及MSP1各等位基因型的多态性。在此基础上,了解恶性疟混合株在短期培养中虫株以及优势虫株的生长变化趋势。 方法：从现场采集的271份滤纸血样本或体外培养的恶性疟原虫血样中提取基因组DNA,用巢式PCR (nested-PCR)方法分别扩增恶性疟原虫裂殖子表面蛋白质1(merozoite surface protein 1, MSP1)和裂殖子表面蛋白质2 (merozoite surface protein 2, MSP2)及谷氨酸富有蛋白(glutamate rich protein, GLURP)中具有特异性的片段,进行基因分型研究。在此基础之上,对鉴定为MSP1基因的36株恶性疟原虫进行各等位基因的序列测定,进一步研究云南省中缅边境恶性疟原虫MSP1基因的多态性。通过对19株恶性疟混合株短期培养,分别提取培养前和后第8天,第14天的基因组DNA,用荧光定量PCR (RT-PCR)方法分别测其的相对表达量,对比培养前后DNA含量的变化,判断混合感染在实验室培养条件下,虫株及优势虫株的生长变化趋势。 结果：1.基因分型(1)MSP1基因分型：单一感染中,271份恶性疟患者血样中有87份扩增出MAD20型单一基因片段,78份扩增出K1型单一基因片段,25份扩增出R033型单一基因片段；(2)MSP2基因分型：单一感染中,271份恶性疟患者血样中有100份扩增出IC/3D7型基因片段,100份扩增出FC27型基因片段；(3) GLURP的基因分型：271份恶性疟患者血样中有262份为单一感染,基因片段在500～1000之间,其中750-850bp大小的分离虫株出现的频率最高,属于优势虫株。混合感染中,MSP1基因中的MAD20和K1型的混合感染为40份,频率最高。K1型、MAD20型和R033型的混合感染为9份；MSP2基因的混合感染为57份。在三个等位基因的综合判断上,单一株为162份,混合株为109份。而MSP1与MSP2两种基因同时出现混合感染的样本只有21份,MSP1、MSP2及GLURP三种基因同时出现混合感染的样本为1份,表明不同基因型的交叉混合感染率很低。自2007年至2010年,在云南省中缅边境地区的恶性疟原虫混合感染率呈逐年上升的趋势。 2、在基因分型的基础之上,对鉴定为MSP1基因的36份恶性疟患者血样进行序列测定,其中3株为混合株(2株为K1型和R033型混合株,1株为MAD20型和R033型混合株)。经DNASTAR软件分析处理后,10株出现K1型,有三个片段长度大小不同的序列,分别为159bp(2株)、168bp(6株)、195bp(2株)；20株出现MAD20型,有4个片段长度大小不同的序列,分别为159 bp(2株)、168 bp(2株)、186 bp(6株)、195 bp(10株),其中186 bp序列出现四种差异(186-1、2各有2株；186-3、4各有1株),195bp序列出现两种差异(195-1有9株、195-2有1株)。9株出现R033型,有1个片段长度为159bp的序列,其中序列出现两种差异。经序列对比分析,发现一个MAD20的新态型—PF-M6。 3、对恶性疟混合株的MSP1基因在不同生长时期的动态研究中,有19个恶性疟血样,K1型和MAD20型混合感染的为18个样本,其中MAD20型在短期培养中DNA含量增多的有13株,K1型有5株；K1、MAD20、RO33型混合感染的只有一个样本,仅有R033型的DNA含量在培养中增多。 结论：云南省中缅边境地区的恶性疟原虫,在MSP1基因中MAD20型出现的频率最高,为优势虫株,K1次之,R033型出现的最少。在MSP2基因中,IC/3D7型和FC27型各占总体的36.9%；GLURP基因以750-850bp大小的分离虫株出现的频率最高,为优势虫株。MSP1基因的混合感染以K1型和MAD20型混合型为主。而MSP1、MSP2、GLURP不同基因的交叉混合感染率则很低。在2007年至2010年各组中,p=0.0770.05,各年份间的MSP1、MSP2和Glurp基因型的总感染情况无显著性差异,而混合感染率呈逐年上升的趋势,在拉咱和瓦邦两地恶性疟感染的对比中,p=0.0190.05,有地区性差异。MSP1的序列测定表明中缅边境地区的恶性疟原虫具有高度复杂的遗传多样性,而MAD20型在各等位基因型总体分布中是占主要优势的。序列对比分析证实了云南省中缅边境地区恶性疟原虫株的等位基因K1、MAD20、RO33型与泰国、越南、坦桑尼亚等相应株/型的序列相一致,在此基础之上,发现了一个MAD20的新态型——PF-M6。恶性疟原虫混合株在体外短期培养后,以MAD20型占优势,生长状态优于其它,其次是K1型,R033型最少,这与以上的基因分型结果一致,证明MAD20型为优势虫株。
[Abstract]:Objective : To investigate the distribution characteristics of Plasmodium falciparum gene typing in China - Myanmar border area of Yunnan Province and the polymorphism of MSP1 alleles using in vitro culture and molecular biology method . Methods : Genomic DNA was extracted from 271 filter paper blood samples collected from the site or in vitro cultured Plasmodium falciparum blood samples . The sequence of merozoite surface protein 1 ( MSP1 ) and merozoite surface protein 2 ( MSP2 ) and glutamic acid rich protein ( GLURP ) were amplified by nested - PCR . Results : 1 . genotyped ( 1 ) MSP1 genotyping : In single infection , there were 87 amplified single gene fragments of MAD20 , 78 amplified out of single gene fragment of type K1 , 100 of which amplified the single gene fragment of type K 1 , and ( 2 ) the mixed infection of MSP1 , MSP2 and GLURP was only 21 , and the mixed infection rate of MSP1 , MSP2 and GLURP was 1 part . 2 . On the basis of genotyping , 36 patients with MSP1 gene were sequenced . Three of them were mixed strains ( 2 strains of type K1 and R33 type , 1 strain MAD20 and R33 type ) . There were two different sequences of length and size of three fragments : 159 bp ( 2 strains ) , 168 bp ( 2 strains ) , 186 bp ( 6 strains ) and 195 bp ( 10 strains ) .


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本文编号：1457803