载脂蛋白E亚型对炎性刺激后施万细胞产生细胞因子和NO的特异性效应

发布时间：2018-01-24 17:19

  本文关键词： 载脂蛋白E 施万细胞 白介素-6 白介素-10 一氧化氮 核因子κB　出处：《吉林大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近十余年的研究证明,载脂蛋白E(ApoE)在中枢神经系统自身免疫性疾病中具有重要的免疫调节功能。SCs作为周围神经髓鞘形成细胞在周围神经系统自身免疫性疾病中发挥重要作用,同时SCs也是被自身免疫反应攻击的目标。许多文献阐述了ApoE不同亚型在周围神经系统免疫性疾病中发挥的差异性作用。目前尚未有人研究不同基因型ApoE对于SCs在周围神经系统中免疫调节功能有何具体影响。 在本次研究中,作者分别从人类ApoE2,ApoE3和ApoE4的转基因小鼠体内提取并培养SCs,以促炎因子脂多糖(LPS)联合干扰素(IFN)-γ施加刺激,然后应用流式细胞学、ELISA等技术比较不同系别小鼠的SCs在体外表达细胞因子,产生一氧化氮的情况,以探讨表达不同人类ApoE基因亚型的SCs在应对炎性刺激时的免疫应答。此外,作者还应用Western blot技术针对细胞信号传导通路做了进一步的研究,试图发现有哪些具体的分子参与到该免疫应答中。 本研究发现炎性刺激后施万细胞的形态发生改变—体积变大,细胞突触减少,边缘变模糊。流式细胞仪检测结果显示本次实验中培养的施万细胞为同系细胞群。超过95%的施万细胞表达载脂蛋白E。另外,流式细胞仪针对抗-S100抗体的检测结果显示本次实验中培养的施万细胞纯度超过96%。 ApoE3促进施万细胞产生IL-6、IL-10和NO。为深入研究不同亚型ApoE在应对炎性应答中的作用,我们对三种转基因鼠(ApoE2,ApoE3和ApoE4)的施万细胞内细胞因子水平(TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10)以及培养液上清中的细胞因子水平(仅IL-6,IL-10和NO)进行了检测。刺激前,流式细胞仪几乎无法探测到SCs胞内TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6以及IL-10的表达量。然而经LPS和IFN-γ刺激72小时后,上述5种细胞因子在各组小鼠的SCs内表达量明显提高。ApoE3转基因小鼠实验组的施万细胞胞内IL-6和IL-10的表达水平明显高于ApoE2和ApoE4组。各实验组中细胞外培养液上清中的IL-6,IL-10和NO相对浓度也随炎性刺激的加入而明显提高。ApoE4转基因小鼠SCs培养基上清中IL-6,IL-10和NO的产生量明显低于ApoE3组。另外炎性刺激前,流式细胞学方法未检测到SCs表达iNOS。而炎性刺激后,流式细胞仪检测出iNOS阳性的SCs比例超过99%。无论从阳性细胞率方面比较,还是从几何平均荧光强度比较,iNOS的表达量在各组间无显著性差异。 ApoE亚型对共刺激分子和ApoE的表达无影响。在免疫炎性应答中,共刺激分子—如CD80、CD86、MHC-II,CD1d和TLR-4等—能否在施万细胞内或表面表达对免疫应答影响很大。炎性刺激前,这些分子几乎难以测得到,而在炎性刺激后,CD80、CD86、MHC-II,CD1d和TLR-4的表达量都有所上升。不过这些分子的表达水平没有组间显著性差异。不论是依靠流式细胞学技术检测平均荧光强度测得的SCs内表达的ApoE含量,还是依靠酶联免疫吸附试验(ELISA)测得的培养液上清中的ApoE浓度,都未发现组间存在显著性差异。 ApoE3抑制信号传导通路中的NFκB和Akt的表达。我们选择了细胞内信号传导通路中的两个重要分子—NFκB和Akt作为研究对象,应用Western blot技术,试图通过对这两种分子在SCs内表达量的不同,探讨不同亚型的ApoE是如何发挥各自的作用的。结果显示,在炎性刺激后,ApoE3的NFκB表达量最低,其次是ApoE4和ApoE2。另外,ApoE3和ApoE4组在刺激后表达Akt分子的水平低于ApoE2组。 结论:(1)在体外实验中,施万细胞是以一种ApoE亚型依赖的模式应对炎症刺激的。(2)在调控局部炎症应答过程中,ApoE3转基因小鼠的SCs比ApoE2和ApoE4转基因小鼠的SCs能够产生更多的细胞因子和NO,因而其免疫调控能力也更强。(3)本研究也许有利于从ApoE基因型的角度解释周围神经系统的炎症性疾病。
[Abstract]:Nearly ten years of research shows that apolipoprotein E (ApoE) is an important immunoregulatory function of.SCs as a peripheral nerve myelin forming cells play an important role in the peripheral nervous system autoimmune disease in the central nervous system autoimmune disease, while SCs is the autoimmune response target. Many described in the literature different effects of different subtypes of ApoE play in the peripheral nervous system disease immunity. Yet there are people of different genotype ApoE has specific effect on SCs in the peripheral nervous system regulate immune function.
In this study, the author respectively from human ApoE2 transgenic mice, ApoE3 and ApoE4 were extracted and cultured SCs, the pro-inflammatory cytokine lipopolysaccharide (LPS) combined with interferon (IFN) gamma stimulus, flow cytometry and ELISA technology application, compare the expression of cytokines in other mouse SCs in vitro, produce no, the immune response is to investigate the expression of human ApoE gene in different subtypes of SCs in response to inflammatory stimuli. In addition, the author also used Western blot technology for cell signal transduction pathways to do further research, trying to find what specific molecules involved in the immune response.
The study found that inflammatory stimulation of Schwann cell morphological changes, cell volume change, synaptic reduction, edge blur. Flow cytometry results showed that cultured Schwann cells in this experiment for homologous cell populations. More than 95% of the Schwann cell expression of apolipoprotein E. in addition, flow cytometry needle the detection of anti -S100 antibody showed the purity of Schwann cells cultured in this experiment, more than 96%.
ApoE3 promotes the IL-6 production of Schwann cells, IL-10 and NO. for further study on effect of different subtypes of ApoE in response to inflammatory response, we have three kinds of transgenic mice (ApoE2, ApoE3 and ApoE4) levels of cytokines in Schwann cells (TNF- alpha, IFN- gamma, IL-4, IL-6 and IL-10) and cell factor level the supernatant (only IL-6, IL-10 and NO) were detected. Before stimulation, almost impossible to detect intracellular SCs TNF- alpha, flow cytometry, IFN- gamma, IL-4, IL-6 and IL-10 expression. However, by LPS and IFN- gamma 72 hours after stimulation, the expression of the 5 cytokines in each group the amount of SCs in mice significantly increased the expression level of the experimental group of.ApoE3 transgenic mouse Schwann cells and intracellular IL-6 and IL-10 were significantly higher than that of ApoE2 and ApoE4 group. In the culture supernatant of IL-6 cells in each experimental group, IL-10 and NO relative concentration with the inflammatory stimulus to join and improve.ApoE4 transgenic Because the mouse SCs IL-6 culture medium supernatant produced IL-10 and NO were significantly lower than that of ApoE3 group. In addition to inflammatory stimulation, flow cytometry method did not detect the SCs expression of iNOS. and inflammatory stimulation, flow cytometry to detect iNOS positive SCs ratio of more than 99%. in terms of the percentage of positive cells. Compared. Or from the geometric mean fluorescence intensity in comparison, no significant difference in the expression of iNOS in all groups.
No effect on the expression of ApoE subtypes of costimulatory molecules and ApoE. The immune inflammatory response, costimulatory molecules, such as CD80, CD86, MHC-II, CD1d and TLR-4 - whether in Schwann cells or surface expression has great influence on the immune response to inflammatory stimuli. Before these molecules hardly can be measured, and in inflammatory stimulation, CD80, CD86, MHC-II, CD1d and TLR-4 expression were increased. But the expression levels of these molecules have no significant differences. Whether the expression is depend on the mean fluorescence intensity of flow cytometry was used to detect the measured SCs content of ApoE, or rely on ELISA (ELISA) ApoE concentration in the culture supernatant were measured and found no significant differences between the groups.
The inhibition of expression of ApoE3 signaling pathway in NF kappa B and Akt. We chose two important molecules and intracellular signal transduction pathways in NF kappa B and Akt as the research object, the application of Western blot technology, through to these two molecules different expression levels in the SCs, to explore the different subtypes the ApoE is how to play their respective roles. The results showed that in inflammatory stimulation, ApoE3 NF K B expression was the lowest, followed by ApoE4 and ApoE2. in ApoE3 and ApoE4 expression in group Akt after stimulation molecular level is lower than the ApoE2 group.
Conclusion: (1) in vitro, Schwann cells is a model in response to inflammation by ApoE subtype dependent stimulation. (2) in the process of regulation of local inflammatory responses in ApoE3 transgenic mice than SCs ApoE2 and ApoE4 SCs transgenic mice can produce more cytokines and NO, and its immune regulation have a stronger ability. (3) this study may benefit from the ApoE genotype to explain the inflammatory diseases of the peripheral nervous system.

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392.12

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本文编号：1460573