局部转染lvOX40Ig和lvCTLA4Ig对同种异体复合组织移植的免疫调节作用及机制研究

发布时间：2018-01-30 20:26

  本文关键词： 异体组织移植 基因治疗 共刺激信号 OX40Ig CTLA4Ig　出处：《第四军医大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 探讨重组lvOX40Ig和lvCTLA4Ig局部转染同种异体复合组织移植阻断共刺激途径，观测目的基因在同种异体复合组织移植后对机体的免疫调节作用，以及局部表达OX40Ig和CTLA4Ig发挥免疫调节机制的研究。 方法: 构建了重组慢病毒载体OX40Ig和CTLA4Ig，体外同种异体复合组织局部目的基因转染，使移植物局部能够分泌OX40Ig和CTLA4Ig融合蛋白。检验慢病毒载体目的基因在293细胞的表达，验证其构建是否成功。采用近交系大鼠下腹壁浅动脉皮瓣移植模型，检验lvOX40Ig和lvCTLA4Ig介导的目的基因局部表达对阻断OX40/OX40L以及CD28/B7共刺激途径、延长移植物存活时间的作用。实验分为6组，组Ⅰ：未处理组；组Ⅱ：LvEGFP组；组Ⅲ：小剂量雷帕霉素治疗组；组Ⅳ：LvOX40Ig联合小剂量雷帕霉素组；组Ⅴ：LvCTLA4Ig联合小剂量雷帕霉素组；组Ⅵ：LvOX40Ig+LvCTLA4Ig联合小剂量雷帕霉素治疗组。比较各组移植物成活状况。检验其在移植物以及全身中的表达，混合淋巴细胞反应检验其免疫调节活性。检测移植后各组免疫细胞，细胞因子以及免疫相关趋化因子的变化。 结果： 体外转染LvOX40Ig和LvCTLA4Ig后，单一雷帕霉素治疗相比较空白对照组移植物存活时间差别有统计学意义，单一灌注LvOX40Ig或者LvCTLA4Ig联合小剂量雷帕霉素治疗与空载体病毒组比较能够显著延长移植物的存活时间，差别有统计学意义（P0.05）。组织病理学检查术后7天，空载体病毒组与空白对照组符合Banff2007标准的Ⅲ级及以上免疫排斥反应，在各个单一基因联合小剂量雷帕霉素组及综合用药组的组织切片中可以观察到移植物存活状态显著提高，显微镜下无免疫排斥反应的表现。移植物术后28天观察显示，空白对照组，空载体病毒组以及雷帕霉素组同种异体皮瓣无一存活。剩余三组LvOX40Ig组，LvCTLA4Ig组以及综合用药组的皮瓣表现出中等程度淋巴细胞浸润。Westernblot以及PCR免疫荧光组织化学显示移植物局部目的基因的高表达，但是内脏器官无目的基因表达，术后45天仍有目的基因的表达。流式细胞术检测CD4，CD8细胞含量以及比值的变化，提示各组与综合治疗组比较CD4+T细胞含量减低，CD4/CD8比值下降，免疫荧光组织化学显示移植物中FOXP3+T细胞含量显著上升。ELISA检测血中各细胞因子含量显示综合治疗组IL-2，INF-γ水平下降，IL-4，IL-10水平明显上升。免疫组织化学检测趋化因CCR5的变化，，可见空白对照组中CCR5阳性细胞数高于综合治疗组的CCR5阳性细胞数。 结论: 实验表明，OX40Ig以及CTLA4Ig局部基因治疗联合小剂量的雷帕霉素协同作用可延长移植物的存活时间。该方法有效地减小了术后早期全身免疫抑制剂的用量，为异体复合组织移植免疫耐受的诱导提供了新方法。
[Abstract]:Objective: Objective: to investigate whether local transfection of recombinant lvOX40Ig and lvCTLA4Ig may block the co-stimulation pathway by allogeneic composite tissue transplantation. Objective to observe the immunomodulatory effect of gene on organism after allogeneic composite tissue transplantation, and to study the mechanism of local expression of OX40Ig and CTLA4Ig. Methods: The recombinant lentivirus vectors OX40Ig and CTLA4 IgG were constructed and transfected with local target gene of allogenic composite tissue in vitro. The fusion protein of OX40Ig and CTLA4Ig could be secreted by the grafts. The expression of the target gene of lentivirus vector in 293 cells was examined. To verify the success of the construction, the model of superficial inferior abdominal artery flap transplantation in inbred rats was used. LvOX40Ig and lvCTLA4Ig mediated local expression of the target gene blocked OX40/OX40L and CD28/B7 costimulatory pathway. The experiment was divided into 6 groups: group 鈪

本文编号：1477157