广谱流感疫苗NM2e免疫保护效果评价的研究

发布时间：2018-02-05 17:15

  本文关键词： 甲型流感病毒 季节性流感疫苗 广谱流感疫苗 免疫保护效果评价　出处：《中国疾病预防控制中心》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：广谱流感疫苗的研究对流感大流行的防控具有重要意义。十几年来,广谱流感疫苗的研究取得了明显进展。其中,基于流感病毒核蛋白(Nucleoprotein, NP)与基质蛋白2胞外区(Matrix protein 2 ectodomain, M2e)多肽的多种广谱流感疫苗在动物研究中显示了较好的免疫保护效果。鉴于大肠杆菌发酵工艺成熟,表达效率高,综合成本低等优势,使用原核表达的NP与M2e作为疫苗的靶抗原已成为广谱流感疫苗研究的重要方向。由于原核表达的NP与M2e诱发的保护性免疫反应较弱,又不能直接采用季节性流感疫苗血凝抑制(Hemagglutinin inhibition, HI)抗体滴度的免疫指标进行评价,因此,选择有效的疫苗靶抗原和佐剂以增强其免疫保护效果,建立合理的疫苗免疫保护评价体系,对疫苗的免疫保护效果进行科学评价,已成为这类广谱流感疫苗临床前研究需要解决的关键问题。为此,本研究在原核系统中成功表达NP及NP与M2e融合蛋白(NM2e)的基础上,对上述问题进行了深入研究。首先对NP与NM2e蛋白亚单位疫苗在BALB/c小鼠中的保护效果进行了比较,并研究了Al(OH)3、CpG及Al(OH)3+CpG对NP与NM2e疫苗保护效果的影响,以确定用于广谱流感疫苗研发的靶抗原与佐剂；其次,鉴于季节性流感疫苗在人群中诱发HI抗体滴度到达40(HI=40)是国际公认的疫苗有效性指标,本研究提出以季节性流感疫苗HI=40对应的同型同株、同型异株、异型异株流感病毒的攻击剂量来评价基于NP与M2e的广谱流感疫苗的保护效果,即,建立以季节性流感疫苗为参考的免疫保护效果评价体系；第三,使用该评价体系,从疫苗交叉免疫保护效果、免疫保护持续时间、免疫剂量和免疫程序对免疫保护效果影响等方面对该疫苗进行全面评价,以便为基于NP与M2e的广谱流感疫苗临床研究提供实验依据。主要研究结果如下：1、确定了以原核表达的NM2e融合蛋白为靶抗原的广谱流感疫苗研发路线。在BALB/c小鼠中进行的比较研究表明,NP蛋白仅能诱发良好的体液免疫反应(106),NM2e融合蛋白除能诱发良好的针对NP的体液免疫反应外,还能诱发一定强度的针对M2e的体液免疫反应(102)；加入AI(OH)3和Al(OH)3+CpG佐剂均能使M2e体液免疫反应增强至104,并能使NP (NP55-69)和M2e特异性细胞免疫由50提高至-200(SFC/106SMNC);使用20LD50 PR8流感病毒攻击,10μg无佐剂NM2e的保护效果(27%)略优于NP(13%),加入A1(OH)3、CpG或Al(OH)3+CpG佐剂均能分别有效增强NP(47%、27%、80%)与NM2e (93%、40%、100%)的保护效果,其中,NM2e的保护效果(93%)明显优于NP(47%);NM2e的保护效果与M2e特异性体液细胞免疫及NP55-69特异性细胞免疫正相关。鉴于Al(OH)3是一种成功的人用疫苗佐剂,本研究确定了以原核表达的NM2e融合蛋白为靶抗原,以Al(OH)3为佐剂的广谱流感疫苗研发路线。2、建立了以季节性流感疫苗为参考的免疫保护评价体系。挑选了5株流感病毒进行鼠肺传代适应,获得了3株鼠肺适应株：与目前H1N1疫苗株同型匹配的两株A1-P5-E1(H1N1)和GD-P40-E1 (H1N1),异型不匹配的一株A3J-P5-E1 (H3N2);通过对季节性流感疫苗在小鼠中的免疫原性、抗体动力学及免疫保护效力研究,确定了季节性流感疫苗在小鼠中HI=40的HA免疫剂量为1.5μg,该免疫剂量可百分之百保护小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒的攻击,但却不能保护小鼠抵御低至3LD50同型异株及异型异株流感病毒的攻击。鉴于流感病毒在小鼠中1个LD50剂量(103-104TCID50)是在人群中飞沫传播感染剂量(102TCID50)的10-100倍,综合分析上述结果,确定了以季节性流感疫苗1.5μg HA免疫为参考,以同型同株、同型异株和异型异株病毒为攻击毒株,以3-1000LD50病毒剂量进行攻击实验的免疫保护评价体系。3、完成了对NM2e广谱流感疫苗免疫保护效果的评价。使用上述评价体系,对NM2e+Al(OH)3疫苗的免疫保护效果研究表明,H1N1季节性流感疫苗1.5μg HA可以分别百分之百保护小鼠抵御100LD50及300LD50同型匹配毒株A1-P5-E1(H1N1)与GD-P40-E1(H1N1)的攻击,但不能保护低至3LD50同型异株PR8(H1N1)和5LD50异型异株A3J-P5-E1(H3N2)的攻击(与对照组0%-33%无明显差异)。NM2e+Al(OH)3疫苗的2.5μg、5μg、10μg3个免疫剂量均能保护50%以上小鼠抵御上述病毒攻击,其中10gg剂量的保护效果最好,对20LD50PR8、100 LD50 A1-P5-E1、300 LD50 GD-P40-E1及30LD50A3J-P5-E1流感病毒攻击后小鼠的保护率分别为100%、100%、50%和67%,具有良好的广谱交叉免疫保护效果,抵御同型异株(A3J-P5-E1)及异型流感病毒(PR8)的效果明显优于季节性流感疫苗：在抗体动力学研究基础上,采用两针(0,14)与三针(0,14,28)免疫程序,NM2e+Al(OH)3疫苗10μg免疫小鼠后的2周、2月和6月均分别可保护90%、70%和50%小鼠抵御20LD50 PR8攻击,免疫保护持续时间可长达至少6个月；使用两针免疫程序(0,28), NM2e中试产品10μg、30μg和90μg的免疫反应与保护效果与实验室产品一致。上述资料为该疫苗的临床研究提供了重要参考。上述研究结果表明,原核表达的NM2e融合蛋白加Al(OH)3佐剂可作为广谱流感疫苗研发的技术路线；以季节性流感疫苗为参考的免疫保护效果评价体系可用于评价基于甲型流感病毒NP与M2e的广谱流感疫苗临床前研究的免疫保护效果；本研究提供的疫苗免疫剂量、免疫程序及相应的免疫保护资料,对该疫苗的临床研究具有重要参考价值。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392
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本文编号：1492397