HGF调控TGF-β1诱导的骨骼肌细胞纤化转型的作用及机制

发布时间：2018-02-06 00:46

  本文关键词： 肝细胞生长因子 转化生长因子-β1 结缔组织生长因子 α-平滑肌肌动蛋白 骨骼肌纤维 纤维化　出处：《第二军医大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的 建立一种高效的骨骼肌细胞分离培养的方法，并在此基础上观察转化生长因子-β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用，探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制，为临床治疗失神经喉肌纤维化提供一种新策略和理论依据。 方法 1、骨骼肌细胞的分离和培养 实验组采用经腹主动脉II型胶原酶灌注法消化骨骼肌，取材C57BL/6小鼠趾长伸肌，D-Hanks液冲洗后移入试管以I型胶原酶和II型胶原酶联合振荡消化；对照组小鼠处死后直接取趾长伸肌，D-Hanks液冲洗后用I型胶原酶振荡消化，以广口吸管研磨肌腹使肌细胞彻底松散。显微镜下对两种分离方法获得的骨骼肌细胞进行计数，各组均选取完整存活的肌细胞进行培养，不同时间点观察存活率。 2、 TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制 C2C12细胞以分化培养基诱导融合为肌管，分化培养72小时后更换培养液为不含血清的DMEM，分别给予不同浓度TGF-β1（0ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,5.0ng/ml）进行干预，12h后实时荧光定量PCR检测各组CTGF和α-SMA在转录水平的变化，Western blot检测CTGF和α-SMA在蛋白水平表达变化。 骨骼肌细胞分离后培养24小时，选取存活且状态良好的肌细胞随机分成实验组和对照组，实验组给予TGF-β1（0.5ng/ml）进行干预。12小时后实时荧光定量PCR检测各组CTGF mRNA和α-SMAmRNA的变化，Western blot检测CTGF和α-SMA蛋白表达变化。 3、 HGF调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制 将分离培养的骨骼肌细胞随机分成三组：①空白对照组②TGF-β1（0.5ng/ml）诱导组（HGF未干预组）③HGF（4ng/ml）和TGF-β1（0.5ng/ml）共同干预组，12小时后实时荧光定量RT-PCR检测各组CTGF mRNA和α-SMA mRNA的变化，间接免疫荧光法和Western blot检测CTGF和α-SMA蛋白分布和表达水平。 4、统计学方法 所有实验结果数据以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS16.0统计软件行统计学处理。先进行各组方差齐性检验，符合方差齐性条件，各组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)和t检验；不符合方差齐性条件，采用非参数检验。P0.05，差异有统计学意义。 结果 1、两种分离方法获得的骨骼肌细胞的数量、生存率 %s5物镜下平均每个视野灌注法获得的肌细胞数为（32.17士2.09）根，研磨法获得的肌细胞数为（10.58士1.15）根，差异有统计学意义（P0.05）。24h灌注法肌细胞存活率是研磨法的3.20倍，48h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2.76倍，72h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2.75倍，各时间点生存率差异均有统计学意义（P0.05）。但灌注法操作时间比研磨法长，且胶原酶消耗大，实验成本高。 2、TGF-β1诱导肌管纤维化转型作用及机制 不同浓度TGF-β1干预下，肌管CTGF mRNA表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高为空白对照组的16.03倍，差异有统计学意义（P0.05）；不同浓度TGF-β1干预下肌管α-SMAmRNA表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的4.52倍，差异有统计学意义（P0.05）。肌管CTGF蛋白表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的1.88倍，差异有统计学意义（P0.05）；肌管α-SMA蛋白表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的1.59倍，差异有统计学意义（P0.05）。 3、TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制 TGF-β1诱导下骨骼肌细胞CTGF mRNA的表达是空白对照组9.55倍，α-SMAmRNA的表达是空白对照组26.82倍，差异有统计学意义（P0.05）。TGF-β1诱导下骨骼肌细胞CTGF蛋白的表达是空白对照组3.63倍，α-SMA蛋白的表达是空白对照组3.38倍，差异有统计学意义（P0.05）。 4、HGF调控TGF-β1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制 HGF干预后CTGF和α-SMA mRNA的表达量明显下降，TGF-β1诱导组（HGF未干预组）CTGFmRNA表达量是HGF干预组6.57倍，TGF-β1诱导组（HGF未干预组）α-SMAmRNA表达量是HGF干预组2.64倍，差异有统计学意义（P0.05）。HGF干预后CTGF和α-SMA蛋白表达量也下降，TGF-β1诱导组（HGF未干预组）CTGF蛋白表达量是HGF干预组2.21倍，，TGF-β1诱导组（HGF未干预组）α-SMA蛋白表达量是HGF干预组1.49倍，差异有统计学意义（P0.05）。各组骨骼肌细胞CTGF和α-SMA免疫荧光均检测到阳性信号，以TGF-β1诱导组（HGF未干预组）信号最强，HGF干预后信号较TGF-β1诱导组（HGF未干预组）减弱。 实验结论： 1、采用胶原灌注法获得骨骼肌细胞数量多，存活率高，比原有方法更具优势。但此法操作时间长，流程较繁琐，需要长期反复实践摸索。 2、TGF-β1可促进骨骼肌细胞和肌管CTGF、α-SMA在转录和蛋白水平的表达，在骨骼肌表型转化进程中发挥重要作用。 3、HGF可以调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞表达CTGF和α-SMA，抑制其表型转化，为治疗失神经喉肌细胞化在细胞和分子水平提供了依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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本文编号：1493174