缺氧与缺氧模拟剂对间充质干细胞的动员作用及机理研究

发布时间：2018-02-11 12:33

  本文关键词： 间充质干细胞 动员 缺氧 缺氧诱导因子-1α 缺氧模拟剂 CoCl_2 去铁胺 AMD3100 成纤维细胞集落形成单位 生物学特性　出处：《浙江大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第1章缺氧对间充质干细胞的动员作用及机理研究 本部分研究首先建立了常压缺氧诱导MSCs动员的动物模型,采用成纤维样细胞集落形成培养法(CFU-F法)研究了缺氧不同时间(1-14天)对大鼠MSCs的动员作用。研究发现：短期缺氧可诱导大鼠MSCs动员进入外周血。当大鼠暴露于缺氧(10%O2浓度)环境中2天,外周血CFU-Fs即MSCs的数量开始显著增加(5.80±0.58/3×106vs.1.40±0.24/3×106,P0.05)。随着缺氧时间的延长,MSCs动员效率增加,呈时间依赖性。而缺氧并不影响大鼠骨髓CFU-Fs数量。我们采用形态学观察、免疫表型测定、三向分化能力检测对缺氧动员外周血来源CFU-F细胞进行鉴定。结果显示：动员外周血来源细胞具有与骨髓MSCs相似的形态；表达CD90、CD29和CD44,而不表达造血系标记CD45、CD34；经诱导可分化为脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞。以上结果说明缺氧动员外周血CFU-F细胞符合MSCs的鉴定标准。 本部分对缺氧诱导MSCs动员的机理进行了进一步研究。通过Western-blot检测发现缺氧诱导因子-1a(HIF-1α)在MSCs动员模型骨髓细胞表达升高。为进一步明确HIF-1α在缺氧诱导MSCs动员中的作用,我们采用HIF-1α的特异性抑制剂YC-1对HIF-1信号进行阻断。结果显示：YC-(10mg/kg/d)显著下调骨髓HIF-1α的表达,同时明显抑制了MSCs的动员。由此我们得出：HIF-1α在缺氧诱导MSCs的动员中起关键作用。 本研究对转录因子HIF-1调控的下游基因血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)在MSCs动员中的作用进行了探讨。VEGF是受HIF-1直接调控的细胞生长因子,能促进新生血管的形成、提高血管通透性。采用免疫组化与ELISA法检测缺氧及对照各组骨髓组织及上清中VEGF的含量,结果显示：缺氧2-7天,骨髓上清与骨髓组织中VEGF含量显著增加。采用免疫组化方法对骨髓中血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)阳性的微血管进行定量,发现：慢性缺氧(7天和14天)骨髓VEGFR3(+)的微血管数量明显增加。SDF-1α在促进MSCs迁移、诱导干细胞动员中起重要作用。ELISA检测外周血中SDF-1α浓度发现,大鼠外周血中SDF-1α浓度在缺氧2-14天较对照组显著增加。迁移是MSCs动员的关键环节之一。采用Transwell法测定MSCs的体外迁移能力示：SDF-1α(150ng/ml)能促进MSCs的迁移,而在缺氧环境,MSCs迁移进一步增加。以上结果说明HIF-1α下游基因VEGF与SDF-1α可能参与调控缺氧诱导MSCs动员。 本部分研究揭示了缺氧诱导MSCs动员的关键机制,为MSCs动员剂的研发提供了靶点与依据。 第2章缺氧模拟剂对间充质干细胞的动员作用及机理研究 HIF-1信号通路在MSCs动员中关键作用的证实为MSCs动员剂的开发提供了思路。铁螯合剂氯化钴(CoCl2)和去铁胺(Deferoxamine, DFX)可抑制常氧状态下HIF-1α的降解,稳定HIF-1α的表达,被称为“缺氧模拟剂”。本部分实验着重研究缺氧模拟剂CoCl2和去铁胺对MSCs的动员作用并探讨其相关机制。通过Western-blot检测证实CoCl2能上调常氧环境培养的MSCs中HIF-1α蛋白表达,在50、75μM时作用最为显著。采用CFU-F法与流式细胞术检测,发现CoCl210mg/kg/d连续给予7天,大鼠外周血CFU-Fs数量较对照组显著增加(1.27±0.08vs.2.37±0.19CFU-Fs/ml, P0.05),且CD45-CD90+细胞群比例升高。同时骨髓CFU-Fs数量也明显增加。以上结果说明：CoCl2(10mg/kg/d×7d)对大鼠MSCs具有动员作用。进一步研究发现,CoCl2给予后,大鼠骨髓HIF-1α表达上调,VEGF浓度增加。 我们检测了缺氧模拟剂CoCl2联合造血干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与AMD3100对MSCs的动员作用。结果显示：与对照组相比,单用G-CSF或AMD3100外周血中CFU-Fs数量并无明显增加。与单用CoCl2组相比,CoCl2联用G-CSF也不能增加MSCs的释放。而CoCl2联合AMD3100可以显著增加MSCs动员效率(3.83±0.32vs.2.37±0.19CFU-Fs/ml, P0.05).流式细胞术检测各组CD45-CD90+细胞群比例显示,CoCl2给药7天可以使外周血中CD45-CD90+细胞群比例升高,且总数增加(2.93±0.40vs.1.46±0.16×104/ml,P0.05),而CoCl2与AMD3100联用后,大鼠外周血中CD45-CD90+细胞群比例与数量较CoCl2组进一步增加。骨髓CFU-Fs检测发现：CoCl2联合AMD3100组骨髓CFU-Fs较单用CoCl2组显著降低(13.8±1.07vs.18.4±1.50,P0.05)。以上结果表明：CoCl2联合CXCR4抑制剂AMD3100可以增加MSCs动员效率。 另外,我们检测了缺氧模拟剂DFX对小鼠外周血CD45-CD105+细胞群比例与数量的影响,发现：DFX可上调小鼠外周血中CD45-CD105+细胞群的比例,增加CD45-CD105+细胞的总数量。 第3章动员外周血来源间充质干细胞生物学特性研究 本部分较为全面地研究了CoCl2联合AMD3100动员外周血来源MSCs (PB-MSCs)与骨髓来源MSCs (BM-MSCs)的生物学特性。采用生长曲线测定发现,PB-MSCs的生长具有与BM-MSCs相似的潜伏适应期、对数生长期和平台期,生长曲线呈“S”型。与BM-MSCs相比,PB-MSCs增殖速度较慢。细胞周期检测显示,PB-MSCs的S期细胞比例较BM-MSCs降低。以上结果说明：PB-MSCs增殖能力较弱于BM-BMCs。 流式细胞术检测PB-MSCs及BM-MSCs的免疫表型,结果显示PB-MSCs不表达造血系标记CD45、CD34,而阳性表达CD44、CD29和CD90。以上几个抗原在PB-MSCs表面表达情况与BM-MSCs相似。 我们采用形态学观察、特异性染色及动态检测分化相关基因表达来评估PB-MSCs的体外成骨、成脂分化潜能。结果发现,在成骨诱导第0、3、7天,成骨分化特异性转录因子Runx2与成骨细胞特异性基因Bglap2在PB-MSCs中的mRNA表达均显著高于BM-MSCs。Von Kossa染色示PB-MSCs有较多的钙盐沉积。在成脂分化第0天与第3天,脂肪细胞特异性基因Lpl在PB-MSCs中的mRNA表达低于BM-MSCs,而成脂分化调控特异性转录因子Pparg2mRNA表达水平在PB-MSCs中各个时间点均显著低于BM-MSCs。油红O染色示PB-MSCs中分化阳性细胞比例较低。以上结果表明：与BM-MSCs相比,PB-MSCs具有较强的成骨分化能力,而成脂分化能力较弱。体外高密度微团培养法及甲苯胺蓝染色检测成软骨分化潜能发现,PB-MSCs与BM-MSCs具有相似的成软骨分化潜能。经β-巯基乙醇体外诱导,PB-MSCs可以分化为Nestin(+)的神经元样细胞,分化能力与BM-MSCs相当。 采用Transwell法检测PB-MSCs的迁移能力,发现PB-MSCs对趋化因子SDF-1α的迁移能力低于BM-MSCs(46.0±4.74vs.70.4±4.51/200×,P0.05)。ELISA检测旁分泌功能,结果显示与BM-MSCs相比,PB-MSCs分泌VEGF显著增加(6935.6±617.2vs.2068.7±243.2ng/ml,P0.05),而分泌IGF、IL-6减少。 综上,我们得出以下结论：(1)短期缺氧可以诱导MSCs动员,随着缺氧时间的延长,MSCs动员效率增加,呈时间依赖性；(2)HIF-1α在缺氧诱导MSCs的动员中起关键作用；(3)HIF-1α可能通过其下游基因VEGF与SDF-1α调控缺氧诱导MSCs的动员；(4)CoCl2可以稳定大鼠骨髓HIF-1α表达,上调VEGF;(5) CoCl2(10mg/kg/d×7d)对大鼠MSCs具有动员作用,且增加骨髓MSCs的数量；(6)COC12联合CXCR4抑制剂AMD3100可以增加大鼠MSCs动员效率；(7)去铁胺可增加小鼠外周血中CD45-CD105+细胞群的比例与数量；(8)动员外周血来源MSCs在体外培养下具有一定的增殖潜能、多向分化能力、迁移能力与旁分泌功能,但与BM-MSCs间存在差异。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

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本文编号：1503070