发现与验证不同压力条件下鼠疫菌的非编码RNA

发布时间：2018-02-12 17:29

  本文关键词： 鼠疫菌 sRNA cDNA文库 RNA组学　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景 非编码RNA(ncRNA)作为基因组最大的一类转录产物,在生物的生长发育和适应环境改变的过程中发挥着不可替代的调控作用。细菌中发挥调节作用的非编码RNA,称为“调节小RNA”(sRNA)。鼠疫的病原菌--鼠疫菌鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)是多一种多宿主寄生菌,面对多宿主复杂的环境因素,鼠疫菌必须能够感应并快速适应每个环节的环境变化,才能最终在宿主体内存活和在自然界中传播并最终致病,而每个适应性反应也必然伴随着严格的基因转录调控。人们已经做了大量关于鼠疫菌的面临环境压力时的适应性调控工作,但大都集中在研究调控基因和蛋白质调控子上。而对于鼠疫菌的sRNA的研究,尤其是在面临复杂环境变化时的sRNA调控,研究工作几乎为空白。在早期的sRNA研究中,大多是采用计算机对基因组预测的方法发现新的ncRNA。但是由于ncRNA没有像mRNA那样的保守序列(ORF,起始和终止密码子,多聚腺苷酸化信号等),且一般较短,因此导致一维结构缺乏足够的统计信号,造成计算机软件预测ncRNA序列远比预测编码蛋白基因困难得多。随后人们采用传统cDNA文库构建的方法来发现新的ncRNA。通过这种方法,在很多物种中都发现了大量新的ncRNA。 方法 本研究是在鼠疫菌基因组测序完成的情况下,构建鼠疫菌50~400nt sRNA的cDNA文库,试图从整个基因组水平上获得更多新的、鼠疫菌特异的ncRNA,为其功能研究奠定基础。本研究旨在鉴定鼠疫菌传播感染过程中参与基因调控的sRNA分子,我们依据鼠疫菌在传播和感染过程中可能面临的环境,设计并实施了多个体外模拟刺激的条件,包括温度、生长时期、铁缺乏(模拟宿主体内低铁环境)、低钙(模拟感染初期III型分泌系统的形成环境)和低镁(模拟巨噬细胞中溶酶体环境)5种刺激因素,对5种条件的鼠疫菌总RNA进行提取,构建鼠疫菌的sRNA cDNA文库。我们发展了一系列先进的RNA目标片段筛选方法,并将能获得全长RNA序列的RACE技术结合到cDNA文库的构建工作中,因此我们的方法更易于获得真实的、全长的sRNA分子。cDNA文库的测序结果进行基因组定位、筛选等一系列深入分析,对得到的序列进行分类,每一类中挑选出有代表性的若干sRNA进行Northern Blot和RACE的实验,验证其完整性和真实存在性,并对文库中得到的70nt以上的sRNA进行Real-time PCR的定量分析。最后,通过RNA二级结构的预测软件Mfold对获得的对sRNA进行二级结构的预测。 结果 通过上述RNA组学的方法和每一步实验操作严格的质量监控,我们得到了鼠疫菌sRNA文库的2540个有效克隆。与鼠疫菌201株基因组进行比对和定位发现,81.73%的克隆为候选的非编码RNA,而tRNA和rRNA,分别仅占了2.32%和5.16%,证明了我们通过磁珠垂钓的方法对rRNA和干扰序列的去除得到了较理想的效果。通过进一步分析,我们共得到了52个、7类候选的sRNA分子,其中包括了5个(9.61%)已知的鼠疫菌sRNA和47个全新的非编码RNA(novel sRNA, nosRNA)。这52个sRNA分子除了两条的长度小于50nt外,其余都集中在50~400nt的范围之内,而且绝大多数来源于鼠疫菌的染色体。我们在每一类sRNA中挑选出具有代表性的sRNA进行定性和定量的深入分析。通过Northern Blot、定量PCR和RACE的实验结果证明,我们实验中得到的绝大多数sRNA都是真实存在的并且基本得到了全长,而且几乎所有的sRNA在5种条件下都是有表达并有部分表现出了明显的表达差异。此外,通过对相邻基因启动子的敲除实验,我们还证明了一类新的sRNA(UTR sRNA)是独立存在的。通过对sRNA进行了二级结构的分析,发现几乎所有的sRNA都包含茎-环的结构,且有些自由能较高。 结论 本研究所用的建库方法是可行的,cDNA文库相对来说比较完整,片段覆盖的范围较广,得到ncRNA在文库中所占的比例较大,获得新ncRNA的效率较高,并且得到的序列大都是真实可信的。尽管我们给出的鼠疫菌sRNA的信息还不全面,而且还有赖于后续研究的补充甚至更正,但仍然为鼠疫菌基因sRNA的发现及其调控网络的构建及基因功能的预测方面迈出了关键的一步。
[Abstract]:Background Non - coding RNA ( ncRNA ) plays an irreplaceable role in regulating the growth , development and adaptation of organisms . method In this study , we have developed a series of advanced RNA target fragment screening methods , including temperature , growth period , iron deficiency ( simulated host low iron environment ) , low calcium ( simulated infection initial stage III secretion system formation environment ) and low magnesium ( simulated macrophage lysosomal environment ) . Results By means of the above - mentioned method and strict quality control , 2540 effective clones of sRNA library were obtained . The results showed that 80.73 % of the clones were non - coding RNAs , while tRNA and rRNA accounted for only 2 . 32 % and 5 . 16 % , respectively , which proved that we obtained 52 , 7 - class sRNA molecules , including 5 ( 9.61 % ) known sRNA and 47 new non - coding RNAs ( novel sRNA , nosRNA ) . In addition , by means of Northern Blot , quantitative PCR and RACE experiments , we have shown that the majority of sRNA from our experiments is truly present and has a significant difference in expression . In addition , by means of Northern Blot , quantitative PCR , and RACE results , we prove that the majority of sRNA in our experiments are truly present and have a partial expression difference . In addition , by analyzing the secondary structure of sRNA , it is found that almost all sRNA contains stem - ring structure , and some free energy can be higher . Conclusion The cDNA library is relatively complete , the coverage of the fragments is relatively complete , the proportion of the ncRNA in the library is relatively large , the efficiency of the new ncRNA is high , and the obtained sequence is mostly true and authentic . Although the information about the sRNA of the plague bacterium is not comprehensive , it also depends on the supplement and even correction of the follow - up study , but it is still a key step in the discovery of the gene sRNA and the construction of the regulatory network and the prediction of gene function .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 陆勇军 ,周惠 ,周惟欣 ,朱远琪 ,屈良鹄;A novel snoRNA gene cluster in yeast is transcribed as polycistronic pre-snoRNAs[J];Science in China(Series C:Life Sciences);1999年05期

，

本文编号：1506173