猪博卡病毒分子生物学特征及感染性克隆构建的初步探索

发布时间：2018-02-16 21:53

  本文关键词： 博卡病毒 环状附加体 感染性克隆　出处：《中国疾病预防控制中心》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：博卡病毒属于细小病毒科博卡病毒属,是近年来细小病毒中的研究热点。由于博卡病毒发现时间较短,其在疾病中的作用,目前尚未定论。而到目前为止,所有发现的博卡病毒在传统的细胞系中培养比较困难,从而无法获得大量高纯度病毒进行下游研究；基因组水平上,除了牛和犬博卡病毒外,其他博卡病毒中对病毒增殖起关键作用的基因组末端反向重复序列(ITRs)尚未攻克,从而无法建立感染性克隆的研究模型。猪博卡病毒是我实验室于2009年首先发现,与人博卡病毒相比具有基因组相似性高、分子生物学特征相近且标本更易获得、标本中病毒载量更高的特点,可作为人博卡病毒研究的良好切入点。本研究在现有工作基础上,应用分子生物学技术尤其是博卡病毒属其他成员的研究方法,发现了一株新型猪博卡病毒并对其基因组结构和生物学特性进行研究；并从基因组末端ITRs入手,在构建猪博卡病毒的感染性克隆和复制机制方面进行了初步探索,以期为人博卡病毒的研究奠定理论和技术基础。 方法： (一)新型博卡病毒的鉴定与分子生物学特征分析 利用新一代高通量454测序技术在健康猪粪便标本中筛查新型别猪博卡病毒(PBoV)的基因片段。选取测序结果中位于NSl保守区并与人博卡病毒3型(HBoV3)序列相似性最高的片段作为目标,采用基因组步移技术狱得了这一新型别PBoV近似全长基因组序列并对其分子生物学特征进行分析和预测。 (二)博卡病毒感染性克隆构建的初步探索 1.利用半巢式PCR方法在PBoV阳性的猪粪便标本中筛查环状附加体形式存在的PBoV,通过反复测序和序列拼接获取其末端非编码区序列。采用软件和在线服务器对其进行序列分析及二级结构的预测。2.利用接头-PCR法扩增线性猪博卡病毒2组(即PBoVG2,为避免本文新方法命名的PBoV2与文献中PBoV2-CHN、 PBoV2-H18等混淆,本文均以PBoVG2表示,而非PBoV2;同样以新方法命名的PBoV3均以PBoVG3表示)基因组末端ITRs。3.运用经典酶切法构建猪博卡病毒2组附加体(PBoVG2e)全基因组克隆。4.针对PBoVG2eNP1保守区片段设计引物和TaqMan探针,建立PBoVG2e实时荧光定量PCR检测方法。 结果： (一)利用高通量测序技术在健康猪粪便标本中发现了一株疑似为新型别的猪博卡病毒,其在健康猪体内检出率高达19.6%。进一步我们获得了这一新型别PBoV近似全长基因组序列PBoV3C(5235nt),发现其与PBoV3A/B (PBoV3/4-UK)和PBoV3D/E (PBoV3/4-HK)的基因组相似性分别达到78%和81%。对所有PBoV做进化分析表明PBoV具有多样性、普遍性和复杂性的特点。另外,在此分析基础上,本研究还提出了基于VPl基因对PBoV命名的方法。 (二)1.在健康猪粪便标本中筛查出2株以环状附加体形式存在的猪博卡病毒PBoVG2e和PBoVG3e并得到其末端非编码区序列(405nt和511nt)。序列分析与结构预测发现PBoVG2e与HBoV3附加体结构相似。2.利用接头-PCR法获得了部分线性PBoVG2基因组末端ITRs并由此确定了基于PBoVG2e构建PBoV全基因组克隆的“头-尾”连接点。3.构建了PBoVG2e全基因组克隆并经序列测定验证正确。4.建立了针对NP1保守区的PBoVG2e的real-time检测方法。其在101拷贝水平可检测出PBoVG2e和PBoV2-CHN,具有重复性和较高的精密度和灵敏度。 结论：本研究在健康猪体内发现了一株新型别猪博卡病毒,对其分子生物学特征进行了分析和预测,并在完成所有PBoV进化分析的基础上,提出了基于VP1基因对PBoV命名的新方法,并据此将本文新发现的PBoV命名为PBoV3C;本研究还构建了基于猪博卡病毒2组环状附加体的全基因组克隆并建立了相应的real-time PCR检测方法,为后续博卡病毒感染性克隆的构建和研究奠定了一定的理论和技术基础。
[Abstract]:Objective: Boka virus belongs to Keboka parvovirus virus, parvovirus is a research hotspot in recent years. Due to the virus found in Boka for a short period of time, its role in the disease, not yet conclusive. So far, all found Boka virus culture difficult in the traditional cell lines, which can not get a lot of high purity virus downstream research; genome level, in addition to cattle and dogs Boka virus, genome has inverted terminal repeats a key role on virus proliferation of other Boka virus (ITRs) has not been overcome, thus unable to establish the research model of infectious clone. Pig Boka virus is first discovered in our laboratory in 2009, compared with Boka has the virus genomic similarity, molecular biological characteristics and similar specimens obtained more easily, the characteristics of viral load were much higher, as one of Boka's disease A good starting point to study the virus. This study on the basis of existing work, the application of molecular biology technology especially the research methods of Boka virus belonging to other members of the discovery of a new strain of swine Boka virus and Study on its genome structure and biological characteristics; and starting from the end of the ITRs genome, a preliminary exploration on and replication mechanism construction of infectious clone of porcine Boka virus, in order to study for the Boka virus lay the theoretical and technical basis.
Method锛，

本文编号：1516515