流体剪切力作用下破骨细胞的钙响应特征及机制
本文关键词： 流体剪切力 破骨细胞 钙振荡 诱导时间 分化 出处：《北京协和医学院》2012年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的：骨组织是结构可动态变化的器官,力学因素在维持其正常代谢活动中发挥重要作用。骨组织内部的多孔间隙内充满间质液,血管压力和机械负荷作用下会使间质液产生流体运动,进而在骨内膜表面产生不同程度的流体剪切力,骨表面的成骨细胞和破骨细胞以及骨基质内的骨细胞在流体剪切力作用下其生物学性质都会发生明显变化。 人体正常的骨代谢主要包括成骨细胞分泌骨基质和破骨细胞吸收陈旧骨基质,其中破骨细胞是目前已知唯一具有骨基质吸收功能的细胞。许多研究表明破骨细胞的形成及其破骨功能和钙离子信号密切相关。钙信号涉及到细胞内信号传导、细胞迁移、分化及骨基质吸收等诸多生物学过程,但目前关于力学因素对破骨细胞的胞内钙离子浓度振荡及细胞功能的影响的研究仍较为缺乏,而这一过程可能对破骨细胞的形成和分化具有重要的生理意义。因此本研究主要关注以下两个问题：在体外培养条件下,流体剪切力能否诱发破骨细胞发生钙响应?如果有钙响应的发生,那么是否会对破骨细胞功能产生影响?解决这两个问题可为临床上调控力学因素对进而影响骨代谢提供科学依据和合理指导。 方法：1、破骨细胞的培养。本研究中采用了三种破骨细胞培养方法,包括使用M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor)和RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor-B Ligand)诱导原代造血干细胞形成破骨细胞、使用M-CSF和RANKL促进RAW264.7细胞形成破骨细胞、使用MC3T3-E1细胞上清诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞。在不同诱导时间(0天、4天和8天)对破骨细胞的相关特性,例如如凋亡、细胞核数目与面积关系等,进行了分析探讨。 2、流体剪切力诱发破骨细胞的钙响应特征及分析。使用Fluo-4AM对破骨细胞内钙离子进行染色,然后将细胞玻片放置于流动腔装置内,使用流动腔加载系统对破骨细胞施加1或10dyne/cm2大小流体剪切力作用10分钟,并使用荧光显微镜记录摄像,然后使用相关软件对数据进行统计分析。 3、流体剪切力诱发破骨细胞钙响应的机制研究。在体外培养条件下,在破骨细胞染色结束后,分别加入不同阻断剂,包括阻断细胞表面机械敏感钙离子通道MSCC (Mechanosensitive Calcium Channel)、抑制细胞内磷酸酯酶C (PLC)活性、阻断细胞表面电压敏感通道L-VSCC (L-type voltage-sensitive calcium channel)、消耗尽细胞内质网内钙离子、阻断细胞表面的ATP受体、阻断细胞的间隙连接、去除细胞外钙离子等7种条件后,观察流体剪切力作用时破骨细胞钙离子浓度变化情况,并与正常未加阻断剂组进行比较分析来判断钙响应的机制。 4、流体剪切力作用后破骨细胞功能产物的变化情况。使用Real-Time PCR技术检测c-Fos基因在不同状态细胞中的表达情况。使用WesternBlot技术检测两种与破骨细胞功能密切相关的蛋白(TRAP和NFATcl)在有、无流体剪切力刺激条件下的表达变化情况,其中NFATcl蛋白与破骨细胞钙信号变化密切相关。 结果：1、MC3T3-E1细胞上清中可检测到可溶型RANKL的表达,此上清可诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞,且破骨细胞核数目与面积存在相关性,因而可根据细胞面积判断其核数目。2、流体剪切力可诱发破骨细胞钙响应的发生,这一响应的强度和形式与流体剪切力的大小、细胞分化程度和细胞核数目有相关性。3、阻断破骨细胞的MSCC、抑制细胞内磷酸酯酶C活性或耗尽内质网内钙离子后,流体剪切力所诱发的破骨细胞的钙振荡几乎完全消失；在去除掉细胞外钙离子及阻断细胞表面ATP受体条件下,部分细胞也会出现钙响应,但一般只出现一个响应峰,无钙振荡的出现；阻断细胞的间隙连接和电压敏感通道后,流体剪切力所诱发的破骨细胞钙振荡强度和形式与正常组相比无明显差别。4、与静止状态下破骨细胞相比,经过流体剪切力刺激的破骨细胞其内c-Fos基因和钙振荡相关蛋白NFATc1表达明显升高,但TRAP蛋白的表达没有变化。结论：1、MC3T3-E1细胞的上清培养液可以促进RAW264.7细胞融合形成TRAP阳性、多核的破骨细胞。2、流体剪切力可诱发破骨细胞发生钙振荡,主要是通过激活细胞表面的机械敏感钙离子通道,进而活化细胞内的PLC酶,使IP3产生增加,促进内质网内钙离子释放形成第一个钙响应峰,胞外钙离子内流和ATP胞外扩散是形成随后的钙响应峰的必要条件；这种钙振荡会促进下游功能蛋白NFATcl的表达增加,使破骨细胞功能增强。3、与RANKL等因子类似,流体剪切力可作为一独立因素诱发破骨细胞钙响应的发生并促进其功能的增强。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329
【共引文献】
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，本文编号：1521842
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