重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶蛋白的研制

发布时间：2018-02-22 13:57

  本文关键词： rhBHMT 表达 纯化 HCY 高同型半胱氨酸血症　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:建立一种制备重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(recombinant human betaine-homocysteine S-methyltransferase,rhBHMT)药用蛋白的生物工程技术,获得高纯度并具有稳定生物学活性的rhBHMT药用蛋白,确认其防治高同型半胱氨酸血症的药效学作用。 方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得rhBHMT基因;采用大肠杆菌BL21作为原核表达系统对rhBHMT蛋白进行诱导表达,构建和筛选rhBHMT蛋白高效和可溶性表达的工程菌株。采用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱和CM阳离子层析柱对原核表达的rhBHMT蛋白进行纯化,应用SDS-PAGE、HPLC、Lowry法等试验对所得蛋白进行相对分子质量、纯度、浓度、蛋白含量分析,建立硝普钠显色法对rhBHMT蛋白的活性进行检测。以束缚应激和高蛋氨酸饮食干预两种方式建立高同型半胱氨酸血症Wistar大鼠模型,给予高同型半胱氨酸血症大鼠以不同剂量的rhBHMT蛋白,观测对其血浆HCY水平的影响,研究rhBHMT治疗高同型半胱氨酸血症的生物学作用。 结果:构建了rhBHMT高效、可溶性表达的工程菌株,通过上述生物工程技术系统分离纯化其表达产物,获得了纯度达95 %以上的rhBHMT蛋白。所得蛋白含量为0.01-1.0 mg/ml,相对分子质量约为43kb,在20mmol/L PH7.0的磷酸钠缓冲液中可稳定储存于-20℃条件下。建立了用于检测rhBHMT酶活性的硝普钠显色法,其操作简便、重复性及稳定性好,与氨基酸测定仪检测结果比对的一致性好。以此硝普钠显色法测定该rhBHMT蛋白样品活性约为70 U/mg。给予束缚应激和高蛋氨酸饮食所诱导的高同型半胱氨酸血症大鼠rhBHMT,可以显著降低大鼠血浆同型半胱氨酸水平,且具有明确的剂量效应。 结论:应用生物工程技术,构建了rhBHMT稳定高表达的工程菌株,建立了对表达产物中rhBHMT蛋白的分离纯化工艺,制备了高度纯化蛋白rhBHMT,完成了其重要的理化性质和活性的鉴定,确认了rhBHMT降低高同型半胱氨酸血症大鼠血浆同型半胱氨酸水平的生物学作用。为rhBHMT作为治疗高同型半胱氨酸血症生物工程药物提供了科学基础。
[Abstract]:Objective : To establish a biological engineering technology for preparing recombinant human recombinant human betaine - cysteine ( rhBHMT ) pharmaceutical protein , and to obtain rhBHMT pharmaceutical protein with high purity and stable biological activity , and confirm its effect on preventing and treating hyperhomocysteinemia . Methods : The rhBHMT gene was cloned by polymerase chain reaction ( PCR ) . The recombinant rhBHMT protein was purified by using E . coli BL21 as a prokaryotic expression system . The recombinant rhBHMT protein was purified by DEAE Sepharose Fast Flow chromatography column and CM cation chromatography column . Results : The rhBHMT protein with high efficiency and soluble expression was constructed . The rhBHMT protein was isolated and purified by the above - mentioned biological engineering system . The rhBHMT protein with purity of more than 95 % was obtained . Conclusion : rhBHMT is a highly expressed engineering strain with high expression of rhBHMT . A highly purified rhBHMT has been prepared and its important physicochemical properties and activity have been identified . The biological effects of rhBHMT on the plasma homocysteine level in rats with hyperhomocysteinemia have been confirmed .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R341

【参考文献】

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本文编号：1524572