Caveolin-1-shRNA慢病毒构建及其对TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞通透性增高的影响

发布时间：2018-03-02 06:13

  本文关键词： 肺微血管内皮细胞 通透性 小窝蛋白-1RNAi　出处：《安徽医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的构建caveolin-1基因RNA干扰慢病毒，观察抑制caveolin-1基因表达后对大鼠肺微血管内皮细胞通透性的影响。为进一步研究caveolin-1在ALI/ARDS发病机制中的作用奠定实验基础。 方法体外分离培养RPMVEC；采用RT-PCR及Western blot检测RPMVEC中caveolin-1的表达；选定大鼠caveolin-1基因RNA干扰的靶序列，，合成靶序列DNA，退火成双链后与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7连接；重组pLL3.7-caveolin-1慢病毒载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒后，经限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ酶切鉴定后进行测序鉴定；慢病毒载体质粒pLL3.7和包装质粒VSV-G,RSV-REV,pMDL在脂质体2000的介导下共转染包装细胞293T细胞，包装慢病毒，病毒上清经浓缩后，按一定比例稀释后感染293T细胞，荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达，测定病毒滴度；通过Western blot检测Caveolin-1shRNA慢病毒感染RPMVEC后对caveolin-1基因表达的抑制；通过检测跨内皮细胞电阻观察caveolin-1基因表达抑制对TNF-α所致RPMVEC单层通透性增高的影响。 结果1.体外成功分离、培养RPMVEC。2.通过RT-PCR和Western blot证实RPMVEC表达caveolin-1。3.经酶切和测序证实，成功构建慢病毒表达载体pLL3.7-caveolin-1shRNA。4.包装的慢病毒经浓缩后的病毒悬液滴度为2×108TU/ml。5.Western blot证实慢病毒感染RPMVEC后，caveolin-1的表达明显下调，72h后caveolin-1表达被抑制85%。6.Caveolin-1表达抑制能显著改善TNF-α所致RPMVEC单层TER的降低，与正常RPMVEC刺激组相比，抑制组30min时即出现差异，6h时差异最大，24h后差异不明显。（P＜0.05）。 结论1.RPMVEC表达caveolin-1。2.成功构建大鼠caveolin-1基因RNAi慢病毒。3.慢病毒感染RPMVEC后显著抑制caveolin-1的表达。4.抑制RPMVEC中caveolin-1的表达可显著改善TNF-α致RPMVEC单层通透性的增高。
[Abstract]:Objective to construct caveolin-1 gene RNA interfering lentivirus and observe the effect of inhibiting the expression of caveolin-1 gene on the permeability of rat pulmonary microvascular endothelial cells in order to further study the role of caveolin-1 in the pathogenesis of ALI/ARDS. Methods RPMVECs were isolated and cultured in vitro, the expression of caveolin-1 in RPMVEC was detected by RT-PCR and Western blot, the target sequence of rat caveolin-1 gene RNA interference was selected, the target DNA was synthesized and annealed into double strand, and then connected with the Lentivirus vector pLentilox3.7 which was digested by Xho 鈪

本文编号：1555351