β-1,4-GalT Ⅰ在施万细胞炎症反应中作用的研究

发布时间：2018-03-04 12:25

本文选题：施万细胞　切入点：β-1　出处：《南通大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的研究在炎症因子肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)刺激下施万细胞中β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ(β-1,4-Galactosyltransferase Ⅰ,β-1,4-GalT Ⅰ)的表达改变,探讨其在TNF-α自分泌、细胞增殖及凋亡中的作用及其机制。方法 1.为了研究β-1,4-GalT Ⅰ在施万细胞TNF-α自分泌中的作用,运用50ng/mL重组的大鼠TNF-α刺激体外培养及纯化的大鼠施万细胞,运用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测施万细胞TNF-α自分泌的改变,逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western blot检测TNF-α诱导β-1,4-GalT Ⅰ的表达及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)和p38信号转导通路的激活情况,同时用中和性抗体阻断TNFR1/2的功能,检测其对TNF-α诱导的β-1,4-GalT Ⅰ表达及TNF-α自分泌的影响；在此基础上在施万细胞中分别转染β-1,4-GalT Ⅰ干扰及过表达质粒,分析干预β-1,4-GalT Ⅰ的表达对施万细胞ERK、JNK和p38信号转导通路激活及其介导的TNF-α自分泌的影响。 2.为了探讨β-1,4-GalT Ⅰ在TNF-α诱导的施万细胞增殖及凋亡中的作用,运用不同溶度(0、0.001、0.01、0.1、1、10及100ng/mL)的重组大鼠TNF-α处理施万细胞,运用MTT分析法,分析施万细胞增殖的情况,运用TUNEL分析法,分析施万细胞凋亡的情况,利用Western blot,检测不同溶度TNF-α诱导β-1,4-GalT Ⅰ及TNFR1/2的表达变化。在此基础上,利用基因转染方法增加或减少β-1,4-GalT Ⅰ在施万细胞中的表达,检测ERK1/2、p38与JNK活性及施万细胞增殖和凋亡的改变：同时运用中和抗体干预TNFR1/2的功能,分析介导上述效应的改变。结果 1.施万细胞在50ng/mL重组的大鼠TNF-α刺激24h后,细胞内TNF-α的mRNA水平及培养基中自分泌的TNF-α含量较未处理组明显升高,RT-PCR及Western blot发现胞内β-1,4-GalT Ⅰ的mRNA及蛋白表达水平显著增加。干扰施万细胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表达,TNF-α的自分泌较未干扰组显著降低,而过表达β-1,4-GalT Ⅰ后,施万细胞内TNF-α的自分泌显著提高。运用中和抗体阻断TNFR的功能,发现阻断TNFR1可以逆转TNF-α诱导的β-1,4-GalT Ⅰ的表达及TNF-α的自分泌。Western blot显示,TNF-α可以诱导ERK、JNK和p38信号通路的活化,抑制ERK、JNK和p38可以有效地抑制TNF-α的自分泌。干扰β-1,4-GalT Ⅰ的表达可以抑制TNF-α诱导的ERK、JNK和p38信号通路的活化,而过表达β-1,4-GalTⅠ后,TNF-α自分泌显著增加,但可以被ERK、JNK和p38的抑制剂PD98059、SP600125和SB202190所抑制。 2.MTT法测定细胞增殖表明用不同浓度的TNF-α处理施万细胞12h后,在0.001ng/mL时细胞增殖率显著升高,在100ng/mL时细胞增殖明显抑制,蛋白印迹检测发现细胞凋亡的标志蛋白Caspase-3表达100ng/mL时显著上调,表明不同浓度的TNF-α可以诱导施万细胞的增殖或凋亡。Western blot显示在给予不同溶度TNF-α处理后,施万细胞内0-1,4-GalTⅠ及TNFR1/2的表达发生改变。在β-1,4-GalT Ⅰ过表达的施万细胞中给予低浓度TNF-α处理,PCNA蛋白水平表达的改变及细胞增殖分析发现过表达β-1,4-GalT Ⅰ可以逆转TNF-α诱导的施万细胞的增殖。进一步分析发现,在β-1,4-GalT Ⅰ过表达的施万细胞中,TNF-α诱导的ERK1/2的激活被逆转,并且阻断TNFR2及ERK的抑制剂PD98059可以逆转低浓度TNF-α诱导的施万细胞的增殖。在干扰0-1,4-GalT Ⅰ表达的施万细胞中给予高浓度TNF-α处理,Caspase-3蛋白表达水平的改变及TUNEL分析表明干扰β-1,4-GalT Ⅰ的表达可以逆转高浓度TNF-α诱导的施万细胞凋亡,并且在干扰β-1,4-GalT Ⅰ表达的施万细胞中,观察到TNF-α诱导的JNK和p38的活化被逆转,阻断TNFR1和JNK,p38的抑制剂SP600125、SB202190可以逆转高浓度TNF-α诱导的施万细胞的凋亡。结论 1. TNF-α可诱导施万细胞中β-1,4-GalT Ⅰ的表达,而表达增加的β-1,4-GalT Ⅰ通过激活ERK、JNK、p38信号转导通路和TNFR1促进TNF-α诱导的自分泌,提示β-1,4-GalT Ⅰ可能在TNF-α诱导的自分泌循环中发挥正向调控作用。 2.低浓度TNF-α促进施万细胞增殖,高浓度TNF-α诱导施万细胞凋亡。β-1,4-GalT Ⅰ通过ERK1/2激酶通路和TNFR2抑制低浓度TNF-α诱导的施万细胞增殖,并且可以通过JNK、p38信号通路和TNFR1促进高浓度TNF-α诱导的施万细胞凋亡。提示β-1,4-GalT Ⅰ在TNF-α诱导的施万细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。
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【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【共引文献】