人干细胞生长因子的克

发布时间：2018-03-04 20:12

  本文选题：人干细胞生长因子　切入点：人脐带间充质干细胞　出处：《暨南大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 1.克隆、表达、纯化重组人干细胞生长因子-α(rhSCGF-α)。 2.构建并纯化人干细胞生长因子-α穿膜肽(TAT-SCGF)。 3.研究rhSCGF-α及TAT-SCGF对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的增殖作用。 4.研究rhSCGF-α对hUCMSCs成脂分化的影响。 方法： 1.针对SCGF基因的高GC含量,采用PCR两步法获得hSCGF-α基因,插入入pET-28a(+)载体质粒,构建重组质粒pET-28a-SCGF-α,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株。低温20℃诱导24 h表达,通过Ni2+-NTA柱纯化,获得目标重组蛋白。以巨噬细胞/粒细胞(granulocyte/macrophage, GM)集落形成实验鉴定重组蛋白的生物学活性。MTT法检测rhSCGF-α对hUCMSCs的增殖作用,并比较与标准对照品的差别。 2.采用基因工程技术将hSCGF-α基因重组插入pET-28a(+)质粒DNA,构建TAT-SCGF-28a重组DNA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用包涵体纯化得到的hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF)研究其对人脐带间充质干细胞的增殖刺激作用。 3.在hUCMSCs成脂分化过程中加入rhSCGF-α,利用Westernblot、Realtime PCR技术,通过检测成脂分化的标志基因GPD、PPARγ2来研究rhSCGF-α对hUCMSCs成脂分化的影响。 结果： 1.PCR两步法获得hSCGF-α基因,成功构建pET-28a-SCGF-α重组质粒,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中部分可溶性表达。纯化出的rhSCGF-α单独作用于小鼠GM不形成集落,但协同rmGM-CSF具有集落形成能力,并且集落数目具有浓度依赖性。rhSCGF-α对hUCMSCs作用的增殖率为(10.61±1.09)%,标准品为(10.18±0.96)%。 2.成功构建了穿膜肽重组质粒TAT-SCGF-28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达。纯化得到的TAT-SCGF对人脐带间充质干细胞的增殖能力为(12.95±1.37)%。 3. rhSCGF-α(0.31 ng/ml)对hUCMSCs的成脂分化促进作用在第3 d即可检测到。 结论： 1.利用基因工程技术得到的rhSCGF-α、TAT-SCGF均具有生物学活性；rhSCGF-α与标准品活性比较无显著性差异。 2. rhSCGF-α、TAT-SCGF对hUCMSCs均具有增殖能力。 3. rhSCGF-α(0.31 ng/ml)对hUCMSCs成脂分化具有促进作用。
[Abstract]:Objective:. 1. Cloning, expression and purification of recombinant human stem cell growth factor- 伪 (rhSCGF- 伪). 2. To construct and purify human stem cell growth factor- 伪 transmembrane peptide (TAT-SCGFG). 3. To study the effect of rhSCGF- 伪 and TAT-SCGF on the proliferation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCS). 4. To study the effect of rhSCGF- 伪 on adipogenic differentiation of hUCMSCs. Methods:. 1. In view of the high GC content of SCGF gene, hSCGF- 伪 gene was obtained by PCR two-step method and inserted into pET-28a () vector plasmid. The recombinant plasmid pET-28a-SCGF- 伪 was constructed and transformed into Escherichia coli BL21DE3. The expression of hSCGF- 伪 was induced at 20 鈩，

本文编号：1567121