神经干细胞移植对HIBD新生大鼠Foxg1和p21基因mRNA的影响

发布时间：2018-03-11 03:41

本文选题：神经干细胞　切入点：缺氧缺血性脑损伤　出处：《郑州大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是各种原因引起的脑缺氧和脑血流减少或中断造成大脑水肿及继发重构,持续的脑细胞丢失及脑室周围和邻近皮质白质囊泡化,导致神经细胞大量丢失,引起相应的神经功能障碍,是导致儿童脑性瘫痪的主要原因。近年来随着新生儿抢救技术的提高,发病率逐渐增高。目前中重度HIBD预后不良,而目前的治疗方法疗效有限,寻找有效的细胞重建途径,替代损伤的神经细胞,是治疗HIBD的新的理念和途径,神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)移植是最近研究的新的治疗方法。NSCs是神经细胞的天然前体细胞,是一类具有多分化潜能的未分化细胞,移植后在体内能够分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞等多种神经细胞,从而发挥其替代损伤细胞修复损伤脑组织的作用。NSCs可以从哺乳动物的胎脑、脐血、脐带、骨髓、胎脑、胎盘羊膜细胞干细胞中诱导产生,然而因受多种因素限制,神经干细胞体外诱导成功率不高,且移植后在宿主体内的存活率尚低,因此,基因工程神经干细胞就成为了神经干细胞的主要来源。动物和临床研究实验均已证实用定向分化的神经干细胞移植治疗脑损伤、帕金森氏病、脱髓鞘疾病、老年性痴呆、脑梗塞以及恶性脑肿瘤、脊髓损伤、癫痫等起到了良好疗效,为使用常规方法难以见效的神经疾患治疗提供了广阔的思路和诱人的前景。新生动物脑组织内存在神经干细胞,如何使这些神经干细胞移植后到达治疗区,并定向分化为目的神经细胞一直是科学家们致力研究的热点。已有研究证明,神经干细胞的定向分化受多种因素的制约,包括基因、转录因子以及神经干细胞所处的局部微环境,Foxg1基因便是这诸多因素之一。大量研究表明新生动物HIBD后脑结构与功能重建是胚胎期发育的再现和延续,Foxg1基因在大脑发育过程中扮演着重要角色。Foxg1基因是目前已知的调控大脑结构发育的关键基因,其缺失将导致整个大脑半球发育不良。Foxg1基因在生后仍可持续表达于神经干细胞聚集区的室管膜下区及海马等部位,在神经干细胞增殖和分化过程中发挥着重要作用。然而Foxg1调控神经干细胞增殖分化的机制是什么?在神经干细胞增殖分化过程中发挥着怎样的作用,目前的研究尚无明确回答。国外的研究表明,Foxg1调控神经干细胞增殖可能与抑制p21基因的表达有关。本实验通过脐血源性神经干细胞移植,观察HIBD后新生大鼠脑组织海马区(sub granular zone, SGZ) Foxg1与p21基因mRNA表达的变化,探讨NSCs移植对二者的影响。为基因工程神经干细胞的应用提供理论依据。目的本实验旨在通过分离和培养脐血间充质干细胞,定向诱导其向神经干细胞方向分化,通过尾静脉途径移植入HIBD新生大鼠体内,采用原位杂交法,分别于各时间点测定HIBD及NSCs移植后SGZ区Foxg1基因与p21基因mRNA表达的变化水平,记录二者变化趋势,探讨HIBD及NSCs移植后海马区二者表达变化的关系,从基因水平进一步探讨神经干细胞增殖与分化的调控机制,对提高NSCs移植后在脑组织受损部位增殖与分化效率具有重要意义,为基因工程神经干细胞在临床进一步应用提供理论依据。方法收集健康足月产妇胎盘脐带血,分离出间充质干细胞,采用细胞培养法,培养脐血间充质干细胞,并定向诱导分化,利用免疫细胞化学法鉴定。以7日龄SD新生大鼠为研究对象,共150只,雌雄不限。采用随机数字表法,将其随机分为HIBD-NSCs移植组,HIBD组,假手术组,各组分别50只。采用经典Rice法制作HIBD模型,模型制作后1d将培养的NSCs移植入HIBD大鼠体内,设模型制作成功后3d、7d、14d、21d、28d为观察点。分别于各观察点将大鼠处死,取右侧半球脑组织,10%甲醛液固定,常规石蜡包埋固定,HE染色鉴定模型,以原位杂交法,测定各时间点Foxgl mRNA与p21 mRNA在海马区的表达变化,观察神经干细胞移植对二者表达的影响,探索二者的内在联系。结果 1原代培养的脐血间充质干细胞形态学观察培养的原代MSCs呈圆形,7天后呈短梭形,单个核,折光性较强,后逐渐伸出突起,期间J混有破骨样细胞,体积较大,呈圆形,多个核。28天左右细胞铺满瓶底。 2脐血源性神经干细胞的诱导及鉴定原代细胞铺满瓶底80%时,加入诱导剂hEGF, bFGF,诱导其向神经干细胞方向分化。免疫细胞化学染色,观察Nestin、NSE、GFAP阳性细胞数在诱导后表达较诱导前明显增加。 3 HIBD动物模型鉴定常规HE染色检查结果示：左侧(结扎侧)出现显著的病理变化,SGZ区出现明显的神经元坏死。 4原位杂交检测结果： (1) Foxg1基因mRNA在假手术组SGZ区有表达,在HIBD组和HIBD-NSCs移植组,于模型制作后第7天表达最高,此后逐渐下降。 (2)p21基因mRNA在假手术组SGZ区有表达,在HIBD组和HIBD-NSCs移植组,于模型制作后第7天表达最低,此后逐渐上升。 5统计学结果 Foxg1基因mRNA与p21基因mRNA的表达在HIBD组、HIBD-NSCs移植组及假手术组均呈负相关；在HIBD组,其二者的相关系数r值为-0.743;在假手术组,二者的相关系数为-0.891(P0.05),在HIBD-NSCs移植组,二者的相关系数为-0.841。结论 1 Foxg1基因出生后仍可表达于脑组织SGz区。HIBD可改变体内微环境从而使Foxg1mRNA表达上升,促进脑组织损伤后的结构和功能的修复。NSCs移植后,可改善HIBD后内环境,启动内源性细胞因子的表达,促使Foxg1基因mRNA表达增加,从而抑制细胞凋亡。 2正常脑组织也可表达p21基因mRNA,正常脑组织也存在细胞的程序性死亡。HIBD可导致凋亡相关基因p21基因mRNA的表达增加,最终导致神经细胞的凋亡增加。 3 p21在脑组织海马区的表达随Foxg1基因表达的升高而降低,Foxg1基因可能是p21基因的上游调控基因。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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