结核分枝杆菌38kDa抗原特异TCR基因修饰iNKT细胞及其活性研究

发布时间：2018-03-14 00:07

  本文选题：结核分枝杆菌　切入点：T细胞受体　出处：《南方医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景 结核病(tuberculosis, TB)至今仍是威胁人类健康的主要传染病。近年来,由于人口流动性的增加、结核病控制措施的不完善以及耐药和多重耐药(MDR)结核菌株的产生和流行,导致结核病死灰复燃,成为感染率最高、病死率仅次于艾滋病的传染病。当前我国人口的结核感染率高达44.5%,估算全国活动性肺结核病人500万,位居全球第二位。我国结核病的治疗仍以化疗为主,存在疗程长、毒副作用大等缺点,而且越来越多的结核病患者对抗生素产生耐药性,导致结核病患者久治不愈。因此,亟需开创新的对耐药患者和结核免疫缺陷患者有效的治疗方法! 结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)属胞内寄生菌,体液免疫难以对其发挥作用。机体内结核杆菌的清除需要固有免疫应答和适应性免疫应答的协调作用。iNKT细胞作为T细胞的亚群之一,不仅是天然免疫应答和适应性免疫应答的桥梁,而且是机体抗结核感染的第一道防线,在早期的抗结核免疫反应中具有重要的保护作用。结核病灶中的iNKT细胞被活化后,既能释放γ-干扰素(interferon-γ, IFN-y)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)等细胞因子,激活和趋化巨噬细胞,提高其抗原递呈能力和对胞内结核菌的杀灭；又能通过穿孔素和颗粒酶B (granzyme B, GrB)途径直接杀伤感染的靶细胞,发挥细胞毒作用,清除胞内寄生的结核菌。另外,iNKT细胞还参与结核肉芽肿的形成,有效地减少机体损伤,防止结核杆菌的扩散。 然而,研究发现感染结核的小鼠体内iNKT细胞数量减少,且iNKT细胞失去免疫效力；在活动性肺结核患者体内亦发现iNKT细胞数量下降、功能被抑制。因此,在结核感染早期提高患者体内iNKT细胞的数量和增强iNKT细胞的抗菌活性可能成为抑制结核杆菌生长的有前景的治疗策略。 作为T细胞的亚群,iNKT细胞同样依赖其表面抗原受体(T cell receptor, TCR)识别抗原。人iNKT细胞表面的TCR恒定表达Va24J18/Vβ11,识别抗原谱窄,仅能识别CDld分子递呈的糖脂质抗原；由于结核杆菌表面并不含有CDld分子识别的糖脂质抗原,机体感染结核杆菌以后,iNKT细胞的活化需要依赖于巨噬细胞分泌的内源性糖脂质抗原iGb3。这些限制了iNKT细胞的抗结核活性。因此人为赋予iNKT细胞特异性的抗原识别能力,增加iNKT细胞的抗原识别谱,可以为iNKT细胞应用于早期结核免疫治疗开辟新的途径。 目前,抗原特异的TCR基因修饰MHC限制性T细胞和γδT细胞已得到证实。我们在前期也已成功利用结核抗原特异的TCR基因修饰T细胞,并获得良好的抗结核活性。为增强iNKT细胞的抗结核活性并赋予其特异的杀伤能力,我们利用结核杆菌38kDa抗原特异的CD8+T细胞的TCR基因修饰iNKT细胞,使其表达抗原特异的TCR,通过MHC-1分子递呈抗原发挥免疫效应。 然而,TCR基因修饰同时仍存在一些问题,通过基因转导的方法使本已表达TCR (Vα24J18/Vβ11)的iNKT细胞被强制性配备额外的TCRα、β链,可能导致内外源性TCRα、β错配。因此,细胞表面理论上将存在四种类型的TCR,即内源性TCR、外源性TCR、内源性p与外源性α错配产生的杂合TCR、内源性α与外源性β错配产生的杂合TCR,因错配的TCR没有经过胸腺的阴性选择,可能具有自身免疫性,且胸腺外尚未发现任何机制可以清除携带自身免疫TCR的T细胞,故内、外源性TCR错配增加了自身免疫的风险。同时,四种类型的TCR将竞争细胞表面恒定量的CD3分子及信号传导系统,稀释了外源治疗性TCR的作用。 在本实验中,为使TCRα、β双链均衡表达和避免内、外源性TCR的错配,我们在不改变TCR功能的前提下,利用2A多肽连接a、p双链,利用鼠C区的九个氨基酸替换人TCRC区相应位点的氨基酸。之后,利用逆转录病毒载体将改建后的结核38kDa抗原特异的TCR转染到iNKT细胞中,与未转染的iNKT细胞比较,TCR基因修饰的iNKT细胞在体外能特异有效地对38kDa抗原起作用,这些结果表明,TCR基因修饰iNKT细胞被赋予了特异的识别和杀伤活性。 目的 研究结核抗原38kDa特异TCR基因修饰iNKT细胞体外抗结核活性,为开展结核特异TCR基因修饰iNKT细胞体内抗结核作用研究奠定基础,同时也为其他胞内菌感染、肿瘤、病毒感染等疾病利用iNKT细胞进行免疫治疗提供平台。 方法 1.筛选结核抗原38kDa特异TCR ①淋巴细胞分离液分离健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC);②贴壁法获取DC,IL-4和GM-CSF诱导DC成熟；③磁珠分选出CD8+T细胞；④38kDa抗原刺激DC三轮,诱导抗原特异CD8+T细胞发生克隆扩增；⑤提取CD8+T细胞mRNA,逆转录为cDNA;⑥利用基因扫描(GeneScan)监测刺激前后CDR3谱型变化,找出刺激后单克隆扩增的抗原特异的CD8+T细胞TCR基因家族。 2.构建重组逆转录病毒载体与包装逆转录病毒 ①根据GeneBank报道的人α、p基因家族可变区(variable region, V)和恒定区(constant region, C)基因序列,设计α、p链基因全长序列引物,扩增特异性TCR a、β全长基因；②采用本实验室已经构建好的最小突变C区(其中9个氨基酸被鼠C区相位点的氨基酸替换)替换人a、β全长基因的C区；③利用重组PCR技术,将已最小突变TCR a、β基因通过自剪切多肽2A连接,并克隆至pGEM-T载体测序鉴定。④将测序正确的a、p全长基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；⑤采用磷酸钙转染法,包装逆转录病毒,低温差速离心法浓缩病毒；⑥重组逆转录病毒转染NIH-3T3细胞,利用流式细胞术测定病毒感染NIH3T3细胞GFP的表达量,计算重组逆转录病毒滴度。计算公式：病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞总数×GFP阳性率／病毒浓缩液量(m1)。 3.重组逆转录病毒感染iNKT细胞 ①采用Ficoll密度梯度离心法,分离健康志愿者外周血PBMC, IL-2和KRN7000扩增iNKT细胞；②磁珠分选iNKT细胞；③重组逆转录病毒转染iNKT细胞,流式细胞术检测转染效率,确定最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI;④以最佳MOI将重组病毒转染iNKT细胞；⑤利用PE荧光染料标记的小鼠抗人TCR-Vβ5单抗,流式细胞术检测iNKT细胞表面结核特异TCR的表达。 4.TCR基因修饰iNKT细胞活性测定 按不同效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰iNKT细胞与负载38kDa的DC混合培养,以未转染和空载体转染的iNKT细胞为阴性对照,以鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)和ESAT-6(early secreted antigenic target,6kDa)为非特异性抗原对照；酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测不同时间点iNKT细胞培养上清中IFN-γ、 TNF-α、 GrB的分泌水平,利用时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolved fluoroimmuno-assay, TRFIA)技术,检测TCR基因修饰iNKT细胞对负载38kDa抗原DC的杀伤活性。 5.统计学分析 所有计量资料用平均值±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析(One-WayANOVA)比较iNKT细胞的细胞因子分泌水平以及杀伤水平,方差不齐时用Welch校正,组间两两比较方差齐时用LSD法,方差不齐时用Dunnett'sT3法。检验水准a=0.05,双侧检验。采用SPSS17.0for windows统计软件包进行数据分析。 结果 1.分析刺激前后CDR3谱型,筛选抗原特异TCR CDR3谱型分析表明,结核分枝杆菌38kDa抗原刺激前各TCR Va (α chain variable gene)、 Vβ (β chain variable gene)基因家族的CDR3谱型均呈8个或多于8个峰型的高斯分布(Gaussian distribution),表明各家族均为多克隆性。而38kDa抗原刺激后,部分基因家族谱型发生改变,呈现偏态或者单峰分布,表明这些家族是由于38kDa抗原持续刺激引起的寡克隆或单克隆增生。比较刺激前后CDR3谱型的变化,找出刺激前为多克隆,刺激后呈单克隆扩增的Vα9、Vβ5基因家族。 2.重组逆转录病毒载体的构建以及重组逆转录病毒感染滴度的测定 成功扩增出经最小突变的TCRα9、 β5全长基因,经TA克隆后测序,TCRα9、β5基因V区DNA序列与GeneBank报道的V区序列完全一致,C区的基因序列与预期相符。利用自剪切多肽2A,通过重组PCR,扩增出CD8+T细胞的hVβ5mCβ-2A-hVa9mCa融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒表达载体pMX-hVp5mCβ-2A-hVa9mCa-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将其与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-293,48h后取病毒上清,浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测、计算得重组病毒滴度分别为1.97×107IU/ml。 3.TCR基因修饰iNKT细胞 按不同的MOI,将重组逆转录病毒颗粒感染iNKT细胞。MOI=8时,相差显微镜下观察基因修饰的iNKT细胞高表达GFP。流式细胞术结果显示,TCR基因修饰的iNKT细胞GFP的阳性表达率为36.7%,外源性TCR Vβ5的阳性表达率为60.9%。。 4.TCR基因修饰iNKT细胞的抗结核抗原活性 ①TCR基因修饰iNKT细胞IFN-y分泌水平 iNKT细胞IFN-y分泌水平随效靶比和共培养时间的变化而变化,在E：T=7,共培养18h时TCR基因修饰iNKT细胞IFN-y分泌水平达最高值。按E：T=7,将TCR基因修饰iNKT细胞与负载抗原的DC的混合培养18h,ELISA检测培养上清中的IFN-y的分泌。结果显示,IFN-y的分泌水平组间差异具有统计学意义(F=814.923,P=0.000)。38kDa抗原特异TCR基因修饰组IFN-y分泌量(2225.954±53.655pg/ml)显著高于其它各组,与各对照组相比有显著性差异。 ②TCR基因修饰iNKT细胞TNF-α分泌水平 iNKT细胞TNF-α分泌水平随效靶比和共培养时间的变化而变化,在E：T=20,共培养24h时TCR基因修饰iNKT细胞TNF-α分泌水平达最高值。按E：T=20,将TCR基因修饰iNKT细胞和负载38kDa的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌。结果显示,TNF-α的分泌水平组间差异具有统计学意义(F=l787.767,P=0.000).38kDa抗原特异TCR基因修饰组TNF-a分泌量(1299.701±13.183pg/ml)显著高于其它各组,与各对照组相比有显著性差异(P=0.000)。 ③TCR基因修饰iNKT细胞GrB分泌水平 iNKT细胞GrB分泌水平随效靶比和共培养时间的变化而变化,在E：T=20,共培养24h时TCR基因修饰iNKT细胞GrB分泌水平达最高值。按E：T=20,将TCR基因修饰iNKT细胞和负载38kDa的DC混合培养24h,ELISA检测上清中GrB的分泌。结果显示,GrB的分泌水平组间差异具有统计学意义(F=21635.892, P=0.000)。38kDa抗原特异TCR基因修饰组GrB分泌量(11.3643±0.031pg/ml)显著高于其它各组,与各对照组相比有显著性差异(P=0.000)。 ④TCR基因修饰iNKT细胞的杀伤效应 时间分辨免疫荧光法检测TCR基因修饰iNKT细胞对负载38kDa抗原DC的杀伤活性,结果显示,38kDa抗原特异TCR基因修饰组iNKT细胞杀伤水平随E：T的增大而升高,在E：T=30,共培养4h时,38kDa特异TCR基因修饰组iNKT细胞杀伤活性最高。按E：T=30,将TCR基因修饰iNKT细胞和负载38kIDa抗原的DC混合培养4h,时间分辨荧光免疫法分别检测未转染组、空载体转染组、无关抗原组、相关抗原组、38kDa抗原组iNKT细胞对靶细胞的杀伤活性。结果表明,各组间iNKT细胞对靶细胞杀伤水平差异有统计学意义(F=87.375, P=0.000)。LSD多重比较结果提示,38kDa抗原组iNKT细胞的杀伤活性最强,与各对照组相比有显著性差异(P=0.000)。 结论 ①本研究利用结核分枝杆菌38kDa抗原体外刺激正常人外周血CD8+T细胞,获得38kDa抗原特异TCR,拟转入iNKT细胞,人为赋予其特异性的抗原识别能力。由于转入的TCRα、β链可能与内源性TCR发生错配,为减少内外源性TCRα/β链错配的机率,利用本实验室已成功设计出最小突变C区替换人TCRαp链的C区。我们将TCR基因转染自体iNKT细胞并检测其活性,研究表明抗原特异TCR基因修饰的iNKT细胞在体外具有显著的抗结核抗原活性。 ②本研究首次证实了TCR基因转染iNKT细胞的可行性,为iNKT细胞的细胞免疫治疗提供了新方法,同时也为其它胞内菌感染性疾病的免疫治疗研究提供了平台。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378.911;R392.11

【参考文献】

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1 周明乾;罗微;马骊;温茜;黄永塔;王小宁;;肺结核患者外周血αβT细胞CDR3谱系研究[J];广东医学;2008年08期

2 张建波;方毅敏;黄艳;江丽芳;董涛;朱晓敏;方丹云;赖小敏;;活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析[J];中国免疫学杂志;2007年12期

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本文编号：1608729