外膜蛋白18（Hp1125）参与幽门螺杆菌免疫逃逸机制分析

发布时间：2018-03-17 01:20

  本文选题：Hp1125　切入点：外膜蛋白　出处：《山东大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的 H.pylori(Helicobacter pylori, Hpylori)是一种能够在人类的胃中成功定植的致病微生物,其长期定植可以引起多种胃部疾病,如慢性胃炎、消化性溃疡,并有可能导致为肠化生、胃癌和粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤发生。H.pylori的感染率较高,约有50%的世界人口感染该菌,在我国H.pylori的感染率高达88.5%,而且一般为cagA阳性的高致病菌株,因此幽门螺杆菌感染所导致的疾病在我国更为普遍与严重,世界卫生组织认为幽门螺杆菌感染是导致胃癌的Ⅰ型致病因子,而我国是胃癌高发国家。 宿主具有一系列的防御机制抵御H.pylori的感染,如胃蠕动、胃酸分泌、胃内复杂多变的环境以及宿主的免疫反应。然而,H.pylori能够在胃粘膜成功定植,这归因于其独特的生理结构,如分泌尿素酶。而且宿主免疫应答可以诱导幽门螺杆菌应激反应并表达抗氧应激的分子以及促进吞噬体内粗粒体的形成保护自身不被宿主清除。但是,过去的研究主要着眼于H.pylori如何逃避宿主的先天免疫应答,而其定植必然激活宿主的适应性免疫。过去的研究已经证实H.pylori对宿主树突状细胞(DCs)的成熟和功能有重要的影响,主要引起宿主Th1方向的细胞免疫反应,并且Thl细胞分泌的IFN-y对于H.pylori的定植有重要的影响,H.pylori在正常小鼠体内的定植率明显低于IFN-γ-/-小鼠中的定植率,这说明IFN-y在清除幽门螺杆菌定植方面具有重要作用。然而,H.pylori是如何逃避宿主的适应性免疫,特别是如何逃避IFN-y清除作用研究不多。虽然之前的研究结果暗示IFN-y与H.pylori之间有相互作用,但是他们之间如何作用尚不清楚。 H.pylori的膜中含有丰富的膜蛋白,有30多种,它们对离子运输、细菌粘附、渗透、结构稳定以及诱导信号转导有重要作用,而且有些膜蛋白具有的独特的免疫原性,还可以用来作为疫苗开发。根据对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和土拉热弗朗西丝菌(Francisella novicida)外膜蛋白的研究,我们通过生物信息学的方法锁定了本文所要研究的外膜蛋白-Hp1125,它和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的OprF有较高的同源性,之前的研究发现,绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)膜蛋白与IFN-γ具有靶向结合作用。而H.pylori的Hp1125是否与IFN-γ也具有结合作用尚没有人研究。由于宿主的免疫反应不利于H.pylori的生存和定植,那么宿主免疫应答是否会诱导细菌的严谨应答反应,尤其是是否诱导调控严谨应答基因spoT表达,以及H.pylori的严谨应答反应是否参与调控其逃避IFN-γ所诱导的免疫应答尚不明确。 我们的研究主要探讨外膜蛋白Hp1125在H.pylori适应宿主IFN-γ中的机制,以及H.pylori的严谨应答反应在其中的作用,探究H.pylori逃逸宿主清除的机制,为临床预防和治疗提供线索。 方法 1、体外实验证实IFN-γ刺激可以引起H.pylori的严谨应答反应。在体外用一定浓度的IFN-γ刺激培养至对数期的幽门螺杆1h、2h、4h、8h之后,提取RNA并反转录为cDNA,进行Real-time PCR检测spoT的表达。 2、通过生物信息学的方法在H.pylori中查找绿脓杆菌膜(Pseudomonas aeruginosa)蛋白OprF的同源序列。我们在BLAST和BioCyc database中进行蛋白序列比对和查找。 3、通过同源重组的方法在HP26695菌株中构建Hp1125突变株。用pILL570质粒、pUC18K2质粒和PCR的方法构建敲除质粒。用验证正确的重组质粒电转野生株,筛选成功插入Kanal抗性基因的单克隆。 4、分析外膜蛋白Hp1125对H.pylori适应IFN-γ的影响。用IFN-γ分别处理HP26695和Hp1125突变株1h、2h、4h、8h后,提取RNA进行RT-PCR,然后进行Real-time PCR检测spoT的表达变化；分别提取野生株HP26695和Hp1125突变株的膜蛋白,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离,转到PVDF膜后用5%的BSA封闭,用IFN-γ作为一抗,anti-IFN-γ作二抗,然后用相应的二抗孵育,进行免疫荧光检查。 5、检测相关毒性基因的表达。IFN-γ处理野生株HP26695和Hp1125突变株后,通过Western Blot检测了CagA和NapA的表达变化；然后分别检测了在8h点时,相关基因RNA水平上的变化,包括毒性相关的基因：cagA、vacA、 napA、ureA和ureB;蛋白降解相关基因：dpX、clpP;细菌粘附相关基因：babA。 结果 1、用IFN-γ体外刺激H.pylori野生株后,和对照相比,其spoT的表达逐渐升高,在8h时差异最为显著,说明IFN-y可以引起H.pylori的严谨应答反应。 2、生物信息学的分析发现,H.pylori的膜蛋白Hp1125与oprF具有较高的同源性。 3、在HP26695上成功构建了Hp1125的突变株。 4、用IFN-γ刺激Hp1125突变株发现spoT基因的表达与未用IFN-γ刺激时相似,没有显著的变化。提取的膜蛋白进行Westen-blot检查发现,IFN-γ只在野生株的蛋白泳道中有条带,敲除Hp1125的膜蛋白中未见有条带。 5、用Western Blot检测IFN-γ刺激和未刺激HP26695和Hpl125突变株中不同时间点的CagA和NapA的表达,发现在用IFN-γ刺激野生株8h时,CagA和NapA表达均下降；而同样的处理在Hp1125突变株中未见到明显的变化。RNA水平上的检测同样证实了这一点。幽门螺杆菌其它毒力基因vacA、ureA、 ureB、clpX、clpP和babA等在Hp1125突变株中mRNA表达水平均下调,暗示Hp1125的突变对H.pylori的致病、粘附都有要的影响。 结论 IFN-γ刺激H.pylori野生株时,spoT基因高表达,其毒性相关基因表达降低。当Hp1125不表达时,IFN-γ刺激后其spoT的表达与野生株中无差异,此时相关的毒性基因表达升高。结合我们之前的结果,spoT表达高时,毒性相关基因表达显著低于AspoT突变株。我们可以推测H.pylori可以通过Hp1125这个外膜蛋白识别并结合环境中IFN-γ,激活自身严谨应答反应调控基因spoT,进而调节自身相关分子的表达,以适应外界环境的变化,达到逃避清除的目的。
[Abstract]:objective
H.pylori (Helicobacter pylori Hpylori) is a successful colonization of pathogenic microorganisms in the human stomach, its long-term engraftment can cause several gastric diseases, such as chronic gastritis, peptic ulcer, and may cause intestinal metaplasia, high rate of gastric cancer and mucosa associated lymphatic tissue lymphoma occurred about.H.pylori infection. The 50% of the world's population is infected with bacteria, in our country H.pylori infection rates as high as 88.5%, and generally positive for cagA highly pathogenic strain, therefore Helicobacter pylori infection caused by the disease is more prevalent in our country and the severity of WHO that Helicobacter pylori infection is causing type of pathogenic factor of gastric cancer however, China is a country of high incidence of gastric cancer.
The host has a series of defense mechanism against H.pylori infection, such as gastric motility, gastric acid secretion, the complex environment of stomach and the host immune response. However, H.pylori can succeed in gastric mucosal colonization, which is attributed to its unique physiological structure, such as the secretion of urease. And the host immune response can be induced by Helicobacter pylori stress the expression of molecular reaction and anti oxygen stress and promote phagocytosis in vivo macrinite formation protect itself can not be cleared by host. However, previous studies mainly focus on how to evade the innate immune response of H.pylori host, and the colonization must activate the host adaptive immune. Past studies have confirmed that H.pylori on host dendritic cells (DCs) have an important effect on the maturation and function of cellular immune response is mainly caused by the host, Th1, and Thl cells for H.pylori colonization with IFN-y The important effect of H.pylori in normal mice, the colonization rate was significantly lower than that of IFN- gamma - / - mice in colonization rate, indicating that IFN-y plays an important role in the eradication of Helicobacter pylori colonization. However, H.pylori is how to evade the host adaptive immunity, especially how to escape not much effect on removal of IFN-y. Although previous research results suggesting that the interaction between IFN-y and H.pylori, but how to effect between them is not clear.
Containing membrane protein rich H.pylori film, there are 30 kinds of ion transport, permeability, bacterial adhesion, structural stability and induced signal transduction plays an important role, but some membrane proteins have unique immunogenicity, can also be used as vaccine development. According to Pseudomonas bacilli (Pseudomonas aeruginosa) and Tur Lara Frances bacteria (Francisella novicida) of the outer membrane protein, we locked in this paper to study the outer membrane protein -Hp1125 by bioinformatics method, and Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) was highly homologous to OprF, previous studies have found that Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) and IFN- gamma with target membrane protein to combine. H.pylori Hp1125 and IFN- gamma is also combined with the effect of no research. Because of the host immune response is not conducive to the survival of H.pylori and colonization, the Whether the host immune response can induce the strict response of bacteria, especially whether the expression of spoT is induced, and whether the exact response of H.pylori is involved in regulating its immune response to escape IFN- gamma is not yet clear.
Our research is mainly concerned with the mechanism of outer membrane protein Hp1125 in H.pylori adapting to host IFN- gamma, and the role of H.pylori's strict response in it. We explore the mechanism of H.pylori escape host clearance, and provide clues for clinical prevention and treatment.
Method
1, in vitro experiments confirm that IFN- gamma stimulation can cause the rigorous response of H.pylori. After stimulating IFN- 1h to 2h, 4H and 8h in vitro, RNA was extracted and transcribed to cDNA, and Real-time expression was used to detect the expression of cDNA.
2, we searched for homologous sequences of Pseudomonas aeruginosa OprF protein in H.pylori by bioinformatics. We performed protein sequence alignment and search in BLAST and BioCyc database.
3, homologous recombination method was used to construct Hp1125 mutant in HP26695 strain. PILL570 plasmid, pUC18K2 plasmid and PCR method were used to construct knockout plasmid.
4, analysis of outer membrane protein Hp1125 to adapt to the effects of IFN- on H.pylori. IFN- gamma gamma HP26695 was treated and Hp1125 mutant 1H, 2h, 4h, 8h, RT-PCR expression of RNA was extracted, then Real-time PCR spoT detection; membrane protein of wild strain HP26695 and Hp1125 mutants was extracted by non denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), go to the PVDF film with 5% BSA closed, with IFN- as an anti anti-IFN- gamma gamma, two - two, and then use the corresponding anti incubated immunofluorescence examination.
5, detection of toxicity related gene expression of.IFN- gamma treated wild strain HP26695 and Hp1125 mutant, by Western Blot detection of the expression of CagA and NapA; and then were detected at 8h, RNA level changes of related genes, including virulence related genes: cagA, vacA, napA, ureA and ureB protein; degradation related genes: dpX, clpP; bacterial adhesion related genes: babA.
Result
1, in vitro stimulation of H.pylori wild strain with IFN- gamma, the expression of spoT increased gradually compared with the control, and the difference was most significant at 8h, indicating that IFN-y could cause H.pylori's rigorous response.
2, bioinformatics analysis showed that the membrane protein Hp1125 of H.pylori had high homology with oprF.
3, a mutant strain of Hp1125 was successfully constructed on HP26695.
4, using the IFN- gamma stimulation of Hp1125 mutants revealed the expression of the spoT gene with similar IFN- gamma stimulation, no significant changes in membrane protein extracted. Westen-blot examination showed that only IFN- gamma band in the wild-type protein in the lane, there is no knockout of membrane protein Hp1125 in the band.
5, using Western Blot to detect IFN- stimulation and gamma expression did not stimulate HP26695 and Hpl125 mutant strains at different time points in CagA and NapA, found that stimulation of wild strain 8h by IFN- gamma, CagA and NapA expression were decreased; and the same treatment in the Hp1125 mutant did not see the obvious changes of.RNA level detection also confirmed this point. Other virulence genes of Helicobacter pylori vacA, ureA, ureB, clpX, clpP and babA in Hp1125 mutation levels were down regulated expression of mRNA strains, suggesting that mutation of H.pylori pathogenic Hp1125, have to the effect of adhesion.
conclusion
IFN- gamma stimulated H.pylori wild strains, high expression of spoT gene, its toxicity related gene expression decreased. When the expression of Hp1125, IFN- stimulated the expression of spoT gamma and wild strains had no significant difference, the toxicity related gene expression increased. Combined with our previous results, the expression of spoT is high, the expression of virulence related genes significantly below the AspoT mutant. We can infer that H.pylori can Hp1125 the outer membrane proteins recognize and bind to the environment in the IFN- gamma, activating the stringent response regulation of gene spoT, which regulates the expression of its related molecules, in order to adapt to the change of the external environment, to avoid clearance purposes.

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

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