基于TLR2的通路在日本血吸虫感染中免疫负调作用的研究

发布时间：2018-03-19 06:06

本文选题：日本血吸虫　切入点：TLR2　出处：《南京医科大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：血吸虫病（schistosomiasis）是一类严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病。血吸虫感染免疫学近年来得以快速发展的一个重要动力是人们试图研制抗血吸虫病疫苗，获取化疗“短效”作用与疫苗接种诱导较“长效”的免疫预防作用相结合的双重效益来控制血吸虫病，遗憾的是迄今难有突破。这促使我们考虑到在努力研究和开发血吸虫病疫苗的过程中，不仅要重视现代生物学技术进步所带来的机遇，更重要的是要回归到血吸虫感染免疫学的基础层面，即转向基础科学发现，以寻觅血吸虫病疫苗发展的合理策略和途径。随着感染的进展，血吸虫不同发育阶段的抗原调节着宿主的免疫应答，尤其是虫卵抗原产生后，既下调了免疫病理反应强度，使宿主免遭致死性损害，同时也保护了寄生虫本身不遭到完全的免疫清除。辐照曼氏血吸虫尾蚴疫苗免疫小鼠后抗体和CD4+T介导的、IFN-γ依赖的效应机制是其获得高保护力的重要原因。但是大多数针对血吸虫病的保护性机制研究主要集中于获得性免疫应答的效应端事件，特别是CD4+T细胞介导的细胞免疫以及体液免疫应答，而对天然免疫应答的启动端事件则涉及较少。树突状细胞是天然免疫系统中发挥重要作用的免疫细胞，其表面表达的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs），，能特异性识别病原体表面的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）从而启动即时效应，并最终决定获得性免疫效应的方向。迄今为止，在曼氏血吸虫感染中有关天然免疫应答的研究多集中在虫卵抗原阶段，说明为何在产卵之后宿主呈现Th2型优势应答。这些基于虫卵抗原的研究，提示虫源性分子可通过抗原特异性的PRRs级联通路的靶向作用，启动并支配获得性免疫应答的方向。本实验室前期研究结果显示，在日本血吸虫急性感染过程中，与野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠虫荷与卵荷均降低，细胞免疫应答水平显著增强；而TLR4-/-小鼠则呈现与之相反的表现。这表明TLR2在其中可能起着免疫负性调节的作用。T细胞的活化除了需要TCR-抗原肽MHC分子复合物通过CD3传递第一信号外，还需要协同刺激分子传导的第二信号。淋巴细胞正常功能的维持亦需要刺激性与抑制性协同刺激信号的共同参与，并决定T细胞对抗原特异性刺激的敏感性和应答方式。作为抑制性协同刺激分子的代表，程序性细胞死亡配体1（Programmed Death Ligand1，PD-L1）和程序性细胞死亡配体2（ProgrammedDeath Ligand2，PD-L2）均能与活化的T细胞上的受体程序性细胞死亡1（Programmed death1,PD-1）结合，从而抑制T细胞的活化。鉴于天然免疫识别系统中TLR2是识别虫卵抗原组分的重要受体之一，及其在宿主抵抗感染过程中可能所起的负性调节作用，本研究拟采用TLR2基因敲除（TLR2-/-）与野生型C57BL/6J（B6）小鼠为对照，建立日本血吸虫感染的小鼠模型。为了观察感染/致病结果，于感染后6周通过胸主动脉灌注法计数成虫数及消化肝脏计数虫卵数；为了观察感染后宿主的体液免疫应答特征，以间接ELISA法检测小鼠血清中日本血吸虫特异性IgG/IgG1/IgG2a抗体水平；为了观察感染后宿主的细胞免疫应答特征，以流式细胞术检测脾脏中主要免疫细胞的比例变化，同时以荧光实时定量PCR检测CD4+、CD8+和NK+细胞中基因il12、il10、ifng、il4、gzma、gzmb和fasl的mRNA表达水平。鉴于树突状细胞在天然免疫中的重要作用亦为了观察血吸虫抗原对TLR2表达的影响，体内、体外实验中用血吸虫抗原负载树突状细胞后，以流式细胞术检测其表面TLR2的表达水平，以荧光实时定量PCR检测基因tlr1、tlr2和tlr6的mRNA表达水平。为了观察TLR2缺失对树突状细胞上PD-L表达及T细胞功能的影响，以流式细胞术检测血吸虫抗原负载的树突状细胞表面PD-L1和PD-L2的表达情况，以荧光实时定量PCR检测基因pdl1和pdl2的mRNA表达水平，同时采用TLR2封闭实验进行验证；以流式细胞术检测感染不同时期CD11c+细胞中PD-L1和PD-L2及T细胞中PD-1的表达情况。本研究获得如下主要结果: 1.在日本血吸虫急性感染后过程中，与野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠肝脏总虫卵数明显降低。在日本血吸虫感染后6周，TLR2-/-小鼠的成虫总数和对数没有差异，但是肝脏总虫卵数明显降低，有统计学差异。 2.日本血吸虫感染后，TLR2-/-小鼠抗原特异性IgG/IgG1/IgG2a水平与B6小鼠之间无明显差异，提示TLR2未对抗体应答产生明显的正向或负向调节作用。日本血吸虫感染后6周，TLR2-/-小鼠血清中针对可溶性成虫抗原（SWAP）和可溶性虫卵抗原（SEA）的特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a水平与B6小鼠之间无明显差异。 3.日本血吸虫感染后6周，TLR2-/-小鼠呈现较高的细胞免疫应答强度，Th1型细胞和CD8+T细胞功能均增强，提示TLR2在宿主抵抗感染过程中起着负性调节作用。日本血吸虫感染后6周，观察B6和TLR2-/-小鼠脾细胞中主要免疫细胞的比例，发现CD4+T细胞、CD8+T细胞以及Th1细胞比例在TLR2-/-小鼠均高于B6小鼠，有统计学差异；Th2细胞和Tc1细胞的比例在TLR2-/-小鼠略高于B6小鼠，Tc2细胞的比例则低于B6小鼠，但均无统计学差异。TLR2-/-小鼠CD4+细胞中il12和ifng的mRNA水平显著高于B6小鼠；CD8+细胞中杀伤功能相关基因gzma、gzmb和fasl的mRNA水平显著高于B6小鼠。 4.日本血吸虫虫卵抗原可以上调TLR2的表达，表明血吸虫虫卵抗原中含有可致TLR2表达的成分。B6小鼠来源的CD11c+细胞，经不同发育阶段血吸虫抗原刺激后，SEA显著上调tlr2的mRNA表达水平。检测感染后不同时期B6小鼠脾脏中CD11c+细胞表面TLR2的表达比例，随着感染时程的进展，TLR2的表达逐渐增加，且感染后9周TLR2的表达水平显著高于感染后3周（产卵前）；与0周相比，tlr2的mRNA水平在6周时显著升高。 5. SEA以TLR2依赖的方式诱导DCs上的PD-L2上调，且日本血吸虫感染TLR2-/-小鼠CD4+T细胞表面PD-1的表达降低，提示SEA可能通过诱导DCs表面PD-L2上调的方式引起T细胞功能抑制。与B6-BMDCs相比，SEA不能上调TLR2-/--BMDCs表面PD-L2的表达且pdl2的mRNA表达明显降低。封闭TLR2后，SEA亦不能上调PD-L2的表达。在感染后6周和9周，TLR2-/-小鼠CD11c+B220-细胞表面PD-L2的表达水平低于B6小鼠，尤其在6周时显著降低，有统计学差异；TLR2-/-小鼠CD4+T细胞表面PD-1的表达显著降低，均有统计学差异。两种小鼠CD8+T细胞表面PD-1的表达水平无明显差异。综上，感染日本血吸虫后，与野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠呈现较高的细胞免疫应答强度，Th1型细胞和CD8+T细胞功能均增强；SEA可能通过诱导DCs表面PD-L2上调的方式引起T细胞的功能抑制从而影响感染转归。虫卵抗原中的某些成分可能通过TLR2通路下调宿主的免疫应答，为从血吸虫的虫源性成分中发现可供研究的新型免疫抑制剂提供了新的思路及相应实验证据。结论：基于TLR2的通路在日本血吸虫感染过程中发挥免疫负性调节作用。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】