一株稀有放线菌的分离鉴定和抑菌活性的研究

发布时间：2018-03-20 00:19

本文选题：根际促生菌　切入点：原核病原菌　出处：《暨南大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目前广泛应用的抗生素大部分是由各种放线菌(Actinomycete)所产生,其中的很多种类在医药行业中具有重要的一席之地。放线菌在微生态制剂中也有广泛的应用,即利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成微生物制剂从而发挥相应的效应。但生态系统中各种生物之间存在着十分复杂的关系,因此菌株在繁殖过程中会低频率地发生一些杂交和突变,有可能导致其形态性状和生理作用效应的改变,也需要随时进行检测以确保微生态制剂的安全性和有效性。此外,微生态制剂在菌种选择和配搭时,需要进行一系列的交叉接种试验,研究植物根际的微生物即植物与微生物,微生物与微生物以及土壤与微生物之间的相互作用,为科学合理的选择能够共生、促生的菌株提供参考。基于上述分析,本实验从几种复合微生态制剂中分离出一系列不同的放线菌菌株,与实验室保存的菌株自生固氮菌GNW (Acinetobacter calcoaceticus)和解磷菌HP2(Azotobacter chroococcum)混合接种培养,检测是否因基因杂交、突变等原因而产生具有抑菌作用的菌株。结果分离出一株具有抑菌作用的放线菌菌株—GNF1,根据其形态学特征、生理生化特征和基于16SrRNA基因序列的系统发育分析结果,鉴定其属于链霉菌属(Streptomyces)的一个菌株——细黄链霉菌(Streptonmyces microflavus), GNF1菌株的发酵液提取物中存在具有抑菌作用的活性成分,与植物根际促生菌GNW, HP2以及某些原核病原微生物,如大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和变形杆菌{Proteus vulgaris)等共培养时能不同程度地抑制它们的生长；其发酵液粗提物抗真菌活性较低,能较低水平的抑制真菌,如白地霉(Geotrichum candidum)、白色念珠菌(C.albicans)、克柔假丝酵母(C. krusei)和红色毛癣霉(T richophy ton rubrum); MTT结果显示GNF1菌株的发酵液提取物具有抗肿瘤活性；抗病毒试验结果为阴性,初步推测其不具有抗病毒活性。目的：通过对复合微生态制剂中的菌种与土壤固有微生物之间的相互作用的研究,检测是否存在具有抑菌作用的放线菌菌株,通过形态学特征生理生化特征和16SrRNA序列对比,鉴定种属；进而检验其对一些病原微生物的抗菌作用、抗病毒和抗肿瘤作用,并对其抑菌作用的机制进行初步的研究。研究方法： 1.通过选择性培养基,首先根据形态学差异从市售的微生态制剂中初步分离一系列的不同的放线菌受试菌株； 2.将分离的放线菌菌株与本实验室保存的两种菌株自生固氮菌GNW和解磷菌HP2混合接种培养,通过初步筛选以及管碟法的验证试验,检测是否存在具有抑菌作用的目的菌株； 3.根据其形态学特征、生理生化特征和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果,对目的菌株进行鉴定； 4.发酵液抗菌活性测定法检测抗菌作用(抗细菌、抗真菌)、抗病毒抗肿瘤作用。 5.采用MTT法检测发酵液提取物抗肿瘤活性。实验结果： 1.经过选择性培养基的初步分离鉴定,共得到6株放线菌。初步筛选后,标记为GNF1的菌株与GNW和HP2共培养时,后两者受到抑制作用具有显著性差异；其抑菌物质存在与GNF1的发酵液中,管碟法进一步验证了其抑菌作用。 2.菌株GNF1具有典型的链霉菌属(Streptomyces)的特征：基内菌丝多分枝,不断裂,气生菌丝丰富,孢子链直且长,偶有波曲,孢子呈柱状。菌株在多数培养基上生长良好,气高氏淀粉琼脂上气生菌丝体白至杏仁黄色,成熟时粉红发紫。 3.实验证实菌株GNF1的生长温度范围为10～40℃,最适温度为28℃。生长pH范围为6.0-8.5,最适pH 7.0。淀粉水解、明胶液化、硫化氢产生阴性；不能水解Tween20和酪素(Casein);黑色素产生、牛奶胨化、纤维素水解和硝酸盐还原阴性。菌株GNF1能利用多种物质做碳源和氮源(表3)。菌株GNF1全细胞水解产物中含甘氨酸、天门冬氨酸等氨基酸,含葡萄糖、半乳糖、木糖和核糖等糖类。上述这些结果与链霉菌属特征相符。 4.选用菌株基因组DNA作为PCR的扩增模板,采用细菌16S rRNA通用引物进行16S rRNA的扩增。成功扩增出菌株的16SrRNA。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测正确与否,送大连宝生物公司进行测序。 5.根据16SrRNA序列来构建系统发育树发现,GNF1菌株与细黄链霉菌(Streptonmyces microflavus)的16S rRNA序列仅相差6个碱基,同源性达99.6%。结合菌株的形态和生理生化特征,初步鉴定将GNF1菌株暂定为Streptonmyces microflavus。6.GNF1的发酵液提取物能抑制大肠杆菌(Escherichia coli).金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和变形杆菌(Proteus vulgaris)等革兰氏阴性的病原微生物,其抑菌效果接近链霉素的水平；其发酵液粗提物抗真菌活性较低,能较低水平的抑制真菌,如白地霉(Geotrichum candidum)、白色念珠菌(C.albicans)^克柔假丝酵母(C. krusei)和红色毛癣霉(T richophy ton rubrum);抗病毒试验结果为阴性,初步推测其不具有抗病毒活性。 7、MTT实验结果显示,GNF1菌株发酵液提取物能够抑制肝癌细胞HepG2的活性,而对正常肝细胞L-02无明显抑制作用,推测GNF1菌株发酵液提取物可能含有抗肿瘤的活性成分。结论： 1.成功分离出一株具有抑菌作用的菌株,该菌株为细黄链霉菌的一突变株,其活性物质对多种病原微生物具有较为广泛的抑菌作用效应； 2.鉴于GNF1发酵液粗提物的抑菌活性和抗肿瘤作用,有待深一步研究其作用机制和开发相关抗菌微生态制剂或者是抗肿瘤药物的价值； 3.一些微生态制剂和微生态有机肥应建立相关指标；并定期检测其中的菌株是否有突变等情况,以期能保证产品的安全性和有效性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R379

【参考文献】