DTT诱发内质网应激-自噬过程中活性氧的作用及其调节机制

发布时间：2018-03-20 05:30

本文选题：内质网应激　切入点：自噬　出处：《吉林大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：不同的病理条件如果扰乱了内质网的功能，影响蛋白折叠，即会导致内质网应激的发生。细胞通过活化未折叠蛋白反应和蛋白降解途径如自噬，适应内质网应激。虽然内质网应激通常被视作为一种代偿反应，但是当内质网中的错误折叠蛋白负荷过重时，细胞就会死亡，特别是凋亡性死亡。近来研究表明内质网应激也能诱发自噬性细胞死亡。这表明在内质网应激严重程度不同时，内质网应激及其后续活化的自噬可发挥促细胞存活/死亡的双重作用。已有研究表明内质网中的错误折叠蛋白可诱导生成ROS。微量的活性氧，作为信号分子可以在细胞的一些生理过程中发挥重要的作用，而胞内活性氧水平的显著增高则可快速触发细胞凋亡。此外，内质网应激可以通过激活MAPK信号途径从而诱发自噬。在不同程度的内质网应激条件下，MAPK信号途径的活化水平及其对胞内生成的ROS水平的影响有无改变；ROS对内质网应激触发的自噬的调控作用有无改变，目前尚未有报道。这些转变是否可作为内质网应激触发的自噬对细胞存活产生不同影响的前期指标，尚且有待进一步的研究来验证。目的：探讨在不同程度的内质网应激条件下，，细胞中活性氧ROS对自噬及凋亡的调控作用。方法：利用不同浓度内质网应激诱导剂DTT刺激人宫颈癌Hela细胞复制内质网应激模型。蛋白免疫印迹实验Western Blot方法检测细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK，自噬相关蛋白LC3，MAPK信号途径相关蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK，以及凋亡相关蛋白caspase3及其裂解片段的表达水平。DCFH-DA探针检测细胞内的ROS水平。不同的药物如自噬抑制剂3-MA、活性氧清除剂NAC以及MAPK途径相关抑制剂SB203580、SP600125及UO126等，与DTT合用作用细胞，采用MTT法分别检测自噬、活性氧及MAPK相关信号途径对细胞存活率的影响。流式细胞术检测细胞凋亡率，免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3、p62及内质网应激相关蛋白PDI的表达水平。JC-1试剂盒检测细胞的线粒体膜电势。结果：（1）Western blot检测发现，小剂量DTT作用Hela细胞，可诱导内质网应激蛋白GRP78、p-PERK表达上调，PDI荧光强度略微增强，细胞发生了轻度的内质网应激；同时自噬相关蛋白LC3II表达明显增加，凋亡相关蛋白caspase3裂解片段的表达略微上调，预示着自噬及凋亡被诱导激活。MAPK信号途径相关蛋白p-JNK、p-p38的表达轻度上调，p-ERK的表达显著增强。而Hela细胞在大剂量DTT作用下，内质网应激蛋白GRP78、p-PERK的表达进一步上调，PDI荧光强度显著增强，细胞发生了较重度的内质网应激；同时自噬相关蛋白LC3II表达明显增加，凋亡相关蛋白caspase3裂解片段的表达明显上调，预示着自噬及凋亡的活化水平随着内质网应激程度的加重有所增强。MAPK信号途径相关蛋白p-JNK、p-p38的表达明显上调，p-ERK的表达显著减弱。（2）MTT检测发现，小剂量DTT合用自噬抑制剂3-MA、抗氧化剂NAC，或ERK抑制剂U0126时，细胞存活率都下降，而合用JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580时，细胞存活率增加。这表明自噬、ROS及ERK在内质网应激程度较轻时，主要发挥维持细胞存活的作用，而JNK、p38MAPK信号通路主要发挥促细胞死亡的作用。大剂量DTT合用自噬抑制剂3-MA或抗氧化剂NAC，合用JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂U0126或p38MAPK抑制剂SB203580时，细胞存活率都增加。这表明自噬、ROS及MAPK信号通路在内质网应激程度较重时，主要发挥了促细胞死亡的作用。（3）DCFH-DA探针检测发现，DTT大小剂量组中胞内的ROS水平都有上升。小剂量DTT合用抗氧化剂NAC后，Annexin-v/PI流式细胞术检测发现凋亡率增加，免疫荧光结果显示LC3同p62的共定位水平下降，细胞自噬的活化水平下降。这表明在轻度内质网应激条件下，ROS主要发挥了促进自噬活化及抑制凋亡的作用。与之相反，大剂量DTT与抗氧化剂NAC合用后， Annexin-v/PI流式细胞术检测发现凋亡率下降，免疫荧光结果显示LC3同p62的共定位水平增强，细胞自噬的活化水平增强。这表明在内质网应激程度较重时，ROS主要发挥了抑制自噬活化及促进凋亡的作用。（4）合用p38MAPK抑制剂SB203580后，小剂量DTT中胞内ROS水平明显增加，而大剂量组中胞内ROS水平下降。这表明p38MAPK信号通路可能参与调控胞内ROS水平。JC-1试剂盒检测线粒体膜电势发现，大小剂量DTT处理细胞均可诱导线粒体膜电势显著下降。合用p38抑制剂SB203580后，DTT大剂量组中线粒体膜电势回升，DTT小剂量组中线粒体膜电势无明显改变。这表明p38MAPK在重度的内质网应激过程中，可能通过调节线粒体膜电势，参与调控胞内的ROS的水平，从而影响细胞的存活；而在轻度的内质网应激过程中上述变化不明显，可能是由其它的信号通路参与调控。结论：（1）利用DTT成功复制了不同程度的人宫颈癌Hela细胞内质网应激模型，细胞自噬及凋亡途径被激活。在内质网应激程度较轻时，自噬发挥维持细胞存活的作用；在内质网程度较重时，自噬发挥促细胞死亡的作用。（2）在内质网应激程度较轻时，ROS促进自噬的活化并抑制凋亡，表现出维持细胞存活的作用；在内质网程度较重时，ROS抑制自噬的活化并促进凋亡，表现出促细胞死亡的作用。（3）JNK、p38MAPK信号通路均发挥促进细胞死亡的作用，而ERK信号主要介导细胞的生存过程。在重度的内质网应激过程中，p38MAPK可能通过调节线粒体膜电势，参与调控胞内ROS的水平，从而影响细胞的存活；而在轻度的内质网应激过程中上述变化不明显，可能由其它的信号通路参与调控ROS的水平。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363.1

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