氯胺酮对发育期海马神经元凋亡的影响及机制研究

发布时间：2018-03-20 15:24

本文选题：氯胺酮　切入点：海马　出处：《河北医科大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分新生大鼠海马神经元原代无血清培养、鉴定与形态观察目的：建立一种简单、易行的海马神经元无血清体外培养方法以获得高纯度、高活力的海马神经元；观察原代海马神经元形态学特点，测定细胞生长曲线。方法：取新生24h内SD乳鼠，断头取脑，于预冷D-hanks玻璃皿中，剥离两侧海马，机械分离，移入离心管，离心弃上清，加入Accutase酶消化10~20min，含10%FBS的DMEM洗涤、终止消化，经200目铜滤网过滤。离心弃上清，加入含10%FBS的DMEM液，吹打成细胞悬液。转至塑料培养瓶中，放入培养箱经差速贴壁1h，收获贴壁速度较胶质细胞慢的神经元，吹打后以0.4%台盼蓝染色计数活细胞并调整悬液的细胞密度，按1×106/mL的浓度将细胞种植在Matrigel基膜包被后的盖玻片上，置于细胞培养箱内。24h内全量换含有N2、B27的Neurobasal培养液，其后，每两天半量换液，并在倒置相差显微镜下观察神经元生长情况。取培养7d神经元，采用β-tublinⅢ免疫荧光细胞化学技术鉴定海马神经元纯度。采用MTT法，每隔两天测吸光度值，绘出生长曲线。结果：1刚接种的海马神经元呈圆形，体积小、透亮、呈悬浮状态，培养3h后开始贴壁，接种20h后可见大部分细胞已贴壁，细胞形态多呈梭形、三角形，长出细长突起，长短不一。3d后胞体饱满，多呈梭形，胞浆丰富，细胞聚集成团，突起较前明显增长、增粗，连接成网络。7~10d神经元胞体最丰满，周围光晕明显，突起交织成更加稠密的网络，突起增粗增长且光晕明显，立体感增强。20d后神经细胞开始退化，细胞边缘光晕变淡，突起开始退缩，部分细胞核固缩明显。2原代培养海马神经元，经神经元特异性标记物β-tublinШ单克隆抗体和Hoechst33258荧光染色后在荧光倒置显微镜下鉴定，计算海马神经元纯度为94.2%±3.6%，能够满足进一步的实验要求。3原代海马神经元生长曲线测定显示，海马神经元体外培养条件下经历了生长潜伏期(2~4d)，对数生长期(4~14d)，后进入生长平台期(14~16d)，细胞生长处于停滞状态。结论：1原代SD乳鼠海马神经元，培养10d后细胞形态趋于成熟。相差显微镜下形态呈锥体形、梭形、三角形。2原代培养海马神经元免疫荧光细胞化学染色为β-tublinШ阳性细胞，纯度为94.2%±3.6%。3原代海马神经元培养经历生长潜伏期、对数生长期和平台期。第二部分氯胺酮对发育期海马神经元活力和凋亡的影响目的：不同浓度的氯胺酮培养不同时间，采用MTT法测定氯胺酮对发育期海马神经元活性的影响；采用流式细胞技术测定不同浓度氯胺酮培养12h对神经元凋亡率和细胞周期的影响，，Hoechst33258荧光染色细胞核观察凋亡情况。方法：取原代培养4-5d海马神经元，加入0.1uM、1uM、100uM、300uM、1mM不同浓度氯胺酮，分别作用3、6、12、24h后，测量MTT值。每次实验设空白对照组，即原代培养基。细胞活力=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)。根据MTT结果，取原代培养4-5d海马神经元，在6孔板培养体系中加入不同浓度氯胺酮，继续培养12h，制备标本，上流式细胞仪检测凋亡和细胞周期；Hoechst33258荧光染色细胞核验证流式结果，前期培养及分组同流式检测各组。结果：1氯胺酮对海马神经元活力的抑制具有时间和浓度的交互作用(F=6.227， P0.01)。在不同作用时间下，氯胺酮对神经元活力的影响具有显著差异(F=6.750，P0.01),其中300uM和1mM氯胺酮在处理不同时间后差异具有显著性(F=4.192， P0.05和F=44.444，P0.01)，余各浓度处理不同时间后无显著性差异。当作用时间相同时，不同浓度的氯胺酮对海马神经元细胞活力的影响具有显著性差异（F=136.068，P0.01),与对照组相比300uM和1mM氯胺酮在各个作用时间上均具有显著性差异，以1mM处理24h对海马神经元活力下降最明显，达60%。0.1和1uM氯胺酮分别在24h和12h增加了海马神经元活力(P0.05)。2流式细胞仪检测凋亡率显示，各浓度氯胺酮处理12h对海马神经元凋亡率的影响具有显著差异（F=80.507，P0.01），各浓度氯胺酮同对照组比较，100、300和1000uM浓度有统计学差异，且凋亡率随浓度的增加而增加。细胞周期的检测结果显示，各浓度氯胺酮处理12h对海马神经元细胞周期的G0/G1、S和增殖率的影响具有显著差异（F=109.192, P0.01、F=57.342, P0.01和F=108.726，P0.01），10、100、300和1000uM浓度有统计学差异，随浓度的增加，G0/G1期细胞比率逐渐下降，S期细胞比率和PI逐渐增高，但G_2/M期细胞比率在所有组别中未见统计学差异（F=2.463，P=0.077）。3Hoechst33258荧光染色显示随氯胺酮浓度的增加，呈波纹状或呈折缝样的细胞核逐渐增多，部分染色质高度凝聚、边缘化，1000uM时细胞核甚至裂解为碎块，产生凋亡小体。结论：氯胺酮对海马神经元活力的抑制具有浓度及时间依赖性，随着浓度的增加及作用时间延长，氯胺酮对神经元毒性作用逐渐增强，以1mM最明显。高浓度（100~1000uM）氯胺酮引起发育期海马神经元凋亡率的增加。氯胺酮可促进海马神经元由G_0/G_1期进入S期，但不能进入G2/M期，细胞增殖阻滞于S期。第三部分氯胺酮对发育期海马神经元钙震荡的影响目的：以离体发育期海马神经元为研究对象，探讨氯胺酮对发育期海马神经元胞内自发钙振荡的影响与机制。方法：取培养4-5d的海马神经元，用Krebs-Ringer液清洗三次，Fluo-4AM工作液37oC孵育30min。再用Krebs-Ringer液清洗三次、孵育15分钟以去除细胞表面的非特异性染色。将孵育有Fluo-4AM细胞爬片置于激光共聚焦显微镜特制的灌流槽中，共聚焦显微镜下调焦平面，使海马神经元能清晰显示，用氩离子激光器激发荧光，在激光扫描共聚焦显微镜下对细胞XYT平面进行扫描，扫描频率为1次/s，采用连续扫描的方式记录荧光变化。首先用Neurobasal培养基或含预处理药物的Neurobasal培养基灌流2min作为药物干预前的对照，再换用含有干预药物的Neurobasal培养基（预处理药物和干预药物均以需要的终浓度预先溶解在Neurobasal培养基中），待药物作用1min后，观测药物对神经元钙振荡振幅和频率的影响，时间同样为2min。用半定量测试法来定量分析神经元钙振荡的钙峰，即以胞浆内钙荧光（Fluo-4AM）的荧光值的变化来（F/F_0）表示胞浆内的钙浓度改变。其中F表示某一时点t时胞浆的钙荧光值，而F_0则代表t时点正负10秒内胞浆最低荧光值的算术平均值，以F/F_0㧐1.2定义为一次钙震荡的发生。研究药物包括：氯胺酮、NMDA和MK801。结果：1随机选取海马神经元观察，呈现出典型的钙振荡。这些神经元钙振荡频率为0.042±0.006Hz，振幅（F/F_0）为2.01±0.07。2100μMNMDA干预可使神经元钙振荡的振幅增强，振幅（F/F_0）变化有明显的统计差异（P0.01），而振荡频率差异无统计学意义。40μM MK-801可使海马神经元钙振荡的振幅（F/F_0）和频率明显降低，有明显的统计差异（P0.01）。3在1-10uM范围内，氯胺酮对发育期海马神经元钙振荡的频率和振幅无明显影响。从30uM开始，随着氯胺酮浓度的增加神经元钙振荡的振幅逐渐减小，但30-100uM的氯胺酮对钙振荡频率虽有所抑制但无统计学意义，从300uM开始，氯胺酮对钙振荡频率的抑制有明显统计学意义。3000uM的氯胺酮可使神经元钙振荡完全消失。4分别用100、300、1000uM的NMDA作用于已被1M氯胺酮作用的海马神经元。钙震荡的频率和振幅随着NMDA浓度的增加而逐渐逆转，当NMDA达到1000uM时，钙震荡的频率和振幅被完全逆转。结论：1发育期海马神经元在激光共聚焦显微镜下呈现出典型的钙振荡。2氯胺酮能够呈剂量依赖性的抑制发育期海马神经元的钙震荡，3000uM时，钙震荡完全消失。3NMDA能够逆转氯胺酮对神经元钙震荡的抑制。第四部分PKCγ-ERK信号通路在氯胺酮致发育期海马神经元毒性中的作用目的：通过流式细胞术观察NMDA对氯胺酮神经毒性的影响，采用免疫细胞化学和Western技术检测PKCγ-ERK信号通路在氯胺酮神经毒性中的作用及应用NMDA后的变化。方法：取原代培养4-5d海马神经元进行实验，分为对照组、300uM氯胺酮处理组、300uM氯胺酮加100uMNMDA混合组、100uM NMDA组，即C组、K组、K+N组和N组，培养时间为12h。采用AnxexinV/PI双染法上流式细胞仪检测实验各组海马神经元早期和晚期凋亡率。利用免疫细胞化学和Western blot分析各实验组pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表达的改变。结果：1K组海马神经元无论早期还是晚期凋亡率比C组明显增高（P0.01，P0.01），K+N组与K组相比早期和晚期凋亡率明显降低（P0.01，P0.01），K+N组与C组相比早期和晚期凋亡率仍高（P0.01，P0.05）。2免疫细胞化学检测显示：K组与C组相比pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表达明显降低（P0.01），K+N组与K组相比pPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表达明显升高（P0.01），tPKCγ增高（P0.05），K+N组与C组相比pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表达明显降低（P0.01）。3Western blot分析显示：K组与C组相比pPKCγ、tPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表达明显降低（P0.01）；K+N组与K组相比pPKCγ、pERK1/2、tERK1/2和Bcl-2表达明显升高（P0.01），tPKCγ增高（P0.05）；K+N组与C组相比pPKCγ和pERK1/2表达明显降低（P0.01），tPKCγ（P0.05），tERK1/2和Bcl-2表达变化无统计学意义。结论：1.300uM氯胺酮培养12h可导致发育期海马神经元凋亡增加，使用100uMNMDA可以减轻氯胺酮的毒性作用。2.氯胺酮能够明显抑制PKC γ-ERK信号通路，PKC γ-ERK信号通路的抑制参与了氯胺酮的毒性机制。第五部分氯胺酮对发育期SD幼鼠海马神经细胞凋亡和远期学习记忆功能的影响目的：选择不同剂量氯胺酮对7日龄幼鼠进行连续三天的腹腔注射，观察其对大鼠海马神经细胞凋亡的影响及成年后大鼠学习记忆功能的受损情况。方法：七日龄SD幼鼠76只，随机分四组，每组19只， K_1、 K_2、K_3组分别腹腔注射氯胺酮25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg，C组（对照组）腹腔注射等容量生理盐水，腹腔注射连续三天每天一次，麻醉后把幼鼠放在暖箱中并保持低流量给氧,密切观察乳鼠的皮肤颜色，有无缺氧表现,各剂量组SD幼鼠在注药完毕后与母鼠分离时间均为250min。实验各组随机取5只幼鼠，采用TUNEL法检测海马CA1、CA2、CA3和齿状回神经细胞凋亡情况。各组余14只饲养至60天进行水迷宫实验，检测成年后大鼠学习记忆功能的受损情况。结果：1K3组同对照组比较，海马CA1区和齿状回神经细胞凋亡增加，具有显著差异（P0.01，P0.01）。2在5天的训练期中，前3天实验各组逃逸潜伏期和距离差异无统计学意义。在第4天和第5天，K_3组相比对照组的逃逸潜伏期和游泳距离长，有统计学差异。在第6天的空间探索试验中，与对照组相比K_2和K_3组逃逸潜伏期长，有统计学差异（P0.05，P0.01）。K_3组相比对照组穿越平台的次数和在靶象限的时间比率少于对照组，有统计学差异（P0.05，P0.01）。结论：连续三天给予7日龄SD幼鼠腹腔注射氯胺酮可导致海马神经细胞的凋亡增加，成年后学习记忆能力的损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R338

【参考文献】