维甲酸对丙烯醛作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

发布时间：2018-03-22 00:07

  本文选题：原代分离　切入点：肺泡上皮细胞　出处：《兰州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的建立原代大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的分离、纯化及原代培养的方法,探索丙烯醛对AECⅡ细胞周期的影响,同时观察维生素A酸(RA)能否拮抗丙烯醛对AECⅡ的损伤作用。方法用4.2u/ml的弹性蛋白酶溶液通过气管插管注入肺泡内,消化分离AECⅡ。把细胞悬液接种到包被有大鼠IgG的塑料平皿中纯化细胞。用倒置显微镜观察细胞生长状况,用电镜、碱性磷酸酶显色法(BCIP/NBT)、改良巴氏染色法、单宁酸染色法、免疫组化染色法鉴定AECⅡ并计算细胞纯度。用MTT法检测丙烯醛对AECⅡ活力的影响,流式细胞仪检测在丙烯醛及RA作用下AECⅡ细胞周期的变化。运用反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技术检测P21、P53在mRNA水平的变化。结果分离所得AECⅡ纯度达到90%以上,倒置显微镜下可见细胞呈岛屿状生长,胞浆内可见大量黑色颗粒。电镜下可见细胞内有大量板层小体,其中有些板层小体呈空泡状结构,细胞膜上有绒毛装结构。BCIP/NBT染色可见胞浆内有蓝色颗粒。改良巴氏染色法、单宁酸染色法可见胞浆内有黑色颗粒。抗大鼠肺泡表面活性物质A(SP-A)免疫组化染色呈阳性反应。在丙烯醛作用下,AECⅡ细胞生长明显受到抑制,流式细胞仪检测结果显示,丙烯醛作用下细胞周期被阻滞在G1期,RA对丙烯醛的拮抗作用不明显。RT-qPCR检测结果显示,和对照组相比,丙烯醛作用后P21mRNA表达在其他各组均明显下调,且各干预组之间P21mRNA表达没有明显差异；P53基因表达在对照组和各干预组之间没有明显差异。结论弹性蛋白酶作用温和,不损伤细胞膜,分离所得AECⅡ细胞活力好、纯度高。IgG免疫粘附纯化法操作简单,特异性高,纯化效率较高。电镜、碱性磷酸酶染色(BCIP/NBT)、巴氏染色、单宁酸染色及免疫组化显色等鉴定方法稳定可靠,特异性高。在丙烯醛对AECⅡ细胞周期的影响中,丙烯醛导致AECⅡ生长受抑制,RA对丙烯醛的拮抗作用微弱。P21基因的表达在丙烯醛刺激下明显下调,而未见RA对此具有拮抗作用,P53基因的表达在丙烯醛或／和RA的作用下均未受到明显的影响。
[Abstract]:Objective to establish a method for the isolation, purification and primary culture of primary rat alveolar type 鈪，

本文编号：1646161