力信号作用下细胞表面分子P-selectin及VWF的生物物理特性研究

发布时间：2018-03-22 01:00

本文选题：P-选择素　切入点：反应动力学　出处：《中山大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：本论文以两种分别参与体内两个重要细胞滚动粘附过程的分子——P-选择素(P-selectin)和血管性血友病因子(von Willebrand factor, VWF)分子作为研究对象,研究力(剪切力)调控下两种分子的生物物理特性。VWF分子存在于血浆当中,参与血小板在血管损伤部位的滚动粘附和聚集,为血管修复的重要参与者,而不正常聚集也是诱发血栓形成的重要原因。研究力(剪切力)调控下这两种分子的生物物理特性,对于进一步了解炎症反应、止血、血栓形成等过程有十分重要的意义,同时也将为下一步制药方面的应用带来一定的指导作用。在论文中,针对这两种分子分别应用了两种不同的生物力学实验手段进行研究:利用平行平板流动腔(parallel plate flow chamber, PPFC)在不同剪切力条件下,研究HL-60细胞在P-选择素上的滚动粘附;利用光镊(optical tweezers, OT)和微吸管(micropipette)组建的实验系统研究VWF分子在恒速度拉伸下的解折叠。在流动腔实验中,将悬浮于缓冲液中的HL-60细胞溶液通入到底板铺有P-选择素的流动腔腔体中,使位于HL-60细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)与铺在底板上的P-选择素相互作用,并测得其中的动力学参数。在低P-选择素浓度(200 ng/ml)条件下,HL-60细胞与底面的粘附为瞬时粘附(tether),这种粘附由单分子介导,可测得P-选择素/PSGL-1单分子键的生存时间(lifetime)。当剪切力低于0.15 dyn/cm2时,P-选择素/PSGL-1的生存时间随剪切力增加而增加,体现了逆锁键的性质;当剪切力高于0.15 dyn/cm2时,生存时间随剪切力增加而降低,体现了滑移键的性质。在高P-选择素浓度(500 ng/ml)条件下,P-选择素/PSGL-1可介导HL-60细胞的滚动粘附,模拟了血管壁内白细胞的滚动粘附现象。在此实验条件下,我们测定了细胞的平均滚动速度(mean rolling velocity)、停留时间(stop time)、行走时间(go time)、停留频率、行走频率等参数。在低剪切力范围内,随着剪切力的增加,细胞滚动速度和行走时间都出现先降低后增加的趋势,而停留时间则相反,先增加后降低,剪切阈值在0.15～0.175 dyn/cm2之间,与生存时间的趋势一致。该结果进一步验证了逆锁键向滑移键转变的这一重要现象,也解释了为什么白细胞在正常情况下不会在血管壁内发生滚动粘附,而在炎症反应时会发生。除了常规的正置流动腔实验外,我们还进行了创新性的倒置实验,即将流动腔体整个翻转,使细胞在反重力作用下在流动腔的上表面进行滚动粘附。在此条件下测得的细胞平均滚动速度比正置条件下要低,停留时间和停留频率都与正置条件基本一致,而行走时间则比正置条件要低,说明细胞滚动速度的降低正是因为行走时间的降低造成的。行走时间的降低主要是因为在倒置条件下,细胞发生解离后如果没有在短时间内与壁面再次结合,细胞就会在重力和剪切流作用下快速远离壁面,而在正置情况下,因为重力方向相反,细胞从壁面脱离后不会远离壁面,会有机会再次与壁面结合。因此,倒置实验与正置实验的最大差别在于,倒置实验可以排除这些与壁面完全脱离的细胞,而只留下滚动比较稳定的细胞,从而得到更准确的滚动粘附参数。血浆中的VWF由一到几十个数量不等的二聚体首尾相接而成,分子量越大的VWF越容易发生聚集,同时增加血栓形成的机会。刚从内皮细胞分泌后的VWF分子量比较大,经金属蛋白酶ADAMTS13 ( a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type-1 motif-13, ADAMTS13)切割后才成为大小正常的VWF。患有血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)的病人血浆中有很多超大型的VWF分子(ultralarge VWF multimers, UL-VWF),这是由于病人体内的ADAMTS13有先天性缺陷或后天获得性产生了ADAMTS13的抑制剂造成的。ADAMTS13作用于VWF的切割位点位于A2结构域Tyr1605-Met1606之间。已有研究发现,VWF A2结构域的解折叠对于ADADMTS13是否发挥切割功能起到关键的作用,且重组蛋白构建的单个A2结构域的解折叠力已经测得。然而,通常情况下A2结构域被VWF中的其它结构域所覆盖和稳定,比较稳定,因此处于VWF多聚体中的A2结构域的解折叠仍未被观察。本研究使用了光镊微吸管系统对VWF多聚体的拉伸进行了研究。VWF多聚体拉伸后测得解折叠力为～21 pN的整数倍,解折叠长度为～66 nm的整数倍。除A2结构域外,VWF中所有的结构域均有保持结构稳定的分子内二硫键,不容易在外力作用下发生解折叠,且解折叠长度与A2结构域氨基酸肽链的长度相符,因此实验中测得的解折叠力与解折叠长度极有可能为A2结构域发生的解折叠。此外,为了验证这一推论,我们构建了重组蛋白(A1-A2-A3)3,测得该蛋白的解折叠力(～23 pN)与解折叠长度(～65 nm的整数倍)均接近于VWF多聚体。重组蛋白(A1-A2-A3)3的解折叠力与解折叠长度与VWF多聚体的数据吻合,进一步证明了这是A2结构域在解折叠。为了进一步研究ADAMTS13 spacer结构域对VWF的作用,我们构建了只含有单个spacer结构域的重组蛋白ST2。实验表明,ST2本身没有切割功能,但它的加入可以促进ADAMTS13对VWF的切割。经光镊拉伸实验验证,VWF多聚体在ST2存在的情况下,A2结构域的解折叠力降低了一半,为～10 pN的整数倍。验证了ADAMTS13 spacer结构域通过降低VWF A2结构域的刚度使之更容易解折叠,从而促进ADAMTS13对VWF的酶切作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R312

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