大鼠与小鼠脑内广州管圆线虫幼虫的形态与功能研究

发布时间：2018-03-23 07:07

  本文选题：广州管圆线虫　切入点：宿主　出处：《南方医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonesis, AC)是一种神经系统和肺寄生虫,通常生活在正常宿主(大鼠)的肺动脉中。经过大约一周的时间,成虫排的卵在肺中孵化。卵及一期幼虫在粪便中被排泄,而这些幼虫有可能以某些软体动物作为中间宿主,从而发育成三期幼虫,食用携带三期幼虫软体动物后的大鼠,幼虫将进入其血液循环到达中枢神经系统,然后经过两次脱髓鞘成为幼龄童虫,一旦到达肺动脉分支,它们生长成为成虫并开始排卵,感染后42天时可从大鼠粪便中收集到一期幼虫。而其非正常宿主比如：小鼠,豚鼠,兔子,猕猴和人类,被感染后幼虫将迁移到大脑,不能从脑内钻出进入心脏和肺部发育成熟。广州管圆线虫病从东南亚传播到南太平洋、非洲、印度、菲律宾等国家和地区,报道病例已超过3000例,随着人们饮食习惯的改变以及淡水螺在我国南方地区的区域性扩散,广州管圆线虫病已成为我国部分地区最具潜在危险的食源性寄生虫病之一。广州管圆线虫感染正常宿主和非正常宿主后其发育过程不同,是否是其自身结构以及重要器官在发育过程中的不同造成了广州管圆线虫不能自行穿透非正宿主的脑部入肺发育成熟?它们在虫体发育过程中有何变化?这些问题目前还未见报道。研究认为入侵中枢神经系统是广州管圆线虫幼虫发育的关键阶段,其入侵宿主造成损伤的机制与多种因素有关,除虫体迁徙引起组织机械性损伤和虫体占位导致组织挤压损伤外,幼虫排泄分泌的代谢产物对自身移行也有很重要的作用。据文献报道,广州管圆线虫感染后,在移行过程中会分泌排泄水解蛋白,基质金属蛋白酶(Matrix metal loproteinases,MMPs)MMP-9可从脑脊液嗜酸性粒细胞中释放出来,并与嗜酸性脑膜炎相关联。在宿主的蛋白水解酶中,纤溶酶原／纤溶酶系统是由无活性的纤溶酶原组成,其可被尿激酶或组织形纤溶酶之一激活。酶系统参与基质金属蛋白酶酶原活化的过程。该蛋白酶在许多中枢神经系统疾病中有致病作用。基质金属蛋白酶的明胶酶家族中,MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B),有代谢Ⅳ, Ⅴ,Ⅵ, Ⅹ,and Ⅺ型胶原蛋白的能力。tPA,uPA.MMP-2, and MMP-9的活性可以在脑脊液中被准确的测量,对这些酶的评估可能有助于对神经系统病理变化的研究。据之前的研究表明tPA, uPA可能在BALB/c小鼠嗜酸性脑膜炎中起到作用,另外MMP-9也与小鼠嗜酸性脑膜炎有关。酶是广州管圆线虫感染BALB/c和ICR小鼠脑膜炎的一个有用的标记物。ICR小鼠同KM小鼠同属一种属,同为非正常宿主,一般来说,广州管圆线虫只能在正常宿主体内生长并发育至性成熟。目前还没有确凿的证据证实宿主的免疫反应与基质金属蛋白酶系统的强度相关。分泌蛋白酶的不同是否是造成广州管圆线虫在正常宿主和非正常宿主移行结局的不同?其作用如何?发挥作用的机制具体有哪些?与虫体自身发育是否有关?这些问题尚不明确。广州管圆线虫病作为一种新发流行病,在我国多次爆发流行,并已成为重要的公共卫生问题得到重视。诊断在广州管圆线虫病的防治中起到关键作用,但由于病原学检测的敏感性低,免疫学检测成为该病的重要辅助诊断方法。广州管圆线虫与其他寄生虫抗原存在交叉反应性,近年来对广州管圆线虫诊断抗原的分析取得了较大的进展；而Maleewong等纯化的雌童虫Mr29000、Chye等纯化的5期幼虫Mr204000、Eamsobhan等纯化的Mr31000和Wongkham等纯化的Mr31500抗原均提高了对广州管圆线虫检测的敏感性和特异性,但是其抗原来源的获得比较复杂。对广州管圆线虫感染正常宿主和非正常宿主体,进行体外培养,收集其在不同宿主脑内的分泌蛋白酶,是否具有很好的诊断价值?能否提高诊断的敏感性和特异性?尚无关于广州管圆线虫幼虫分泌代谢抗原用于诊断的报道。目的1.通过建立广州管圆线虫感染大鼠和小鼠动物模型后光镜下观察测量比较大鼠和小鼠脑内感染后第21天幼虫结构,扫描电镜下观察不同宿主脑内幼虫与发育相关的结构。2.广州管圆线虫感染大鼠和小鼠第21天幼虫进行体外培养,对幼虫及收集浓缩排泄分泌产物,进行蛋白谱分析。3.探讨小鼠脑内幼虫分泌抗原诊断价值。方法1.广州管圆线虫感染宿主模型建立观察以及幼虫相关结构观察：使用含1.5g胃蛋白酶人工消化液,37℃消化被广州管圆线虫三期幼虫(L3)感染的白玉蜗牛,2小时后,80目塞网过滤去除组织碎屑,以PBS洗涤滤液3次,静置自然沉淀后收集沉渣中幼虫,以其中50条广州管圆线虫感染期幼虫感染大鼠和小鼠,成功建立广州管圆线虫感染大鼠和小鼠动物模型。大鼠感染模型使用SD大鼠,小鼠使用昆明小鼠以及BALB/c小鼠,模型建立后观察两种宿主生活状态以及感染后症状体征变化；到21dpi解剖采集两种宿主脑中的幼虫,扫描电镜观察分析两种宿主虫体感觉乳突及化学感受器的差异,光镜观察两种宿主脑内幼虫体长、体宽及咽肠比例并分析其差异。2.广州管圆线虫排泄分泌物相关蛋白酶谱分析：感染动物模型建立后,取大鼠和小鼠(BALB/c)感染后第21天幼虫进行体外培养,获得幼虫分泌排泄物。蛋白酶谱分析两种宿主分泌蛋白的差异。3.LESA对早期广州管圆线虫感染的诊断价值：收集小鼠脑内幼虫并制备幼虫排泄分泌抗原(LESA),用成虫制备成虫抗原(AWA)。将两种抗原用于检测感染小鼠以及人类,正常小鼠及人类的不同时间点的IgG和IgM变化趋势,进行统计学对比分析,明确LESA诊断广州管圆线虫的敏感性以及特异性。4.本实验数据均以“均数±标准差”表示。不同宿主脑内幼虫之间结构比较采用Kruskal-Wallis检验分析。率的比较采用卡方检验,变化规律的统计采用方差分析的方法,用SPSS17.0统计分析软件包进行各组数据的医学统计。结果1.广州管圆线虫感染宿主模型建立观察以及幼虫相关结构观察1.1感染后宿主观察广州管圆线虫感染模型建立后观察发现：小鼠模型约自13dpi开始逐渐出现毛发湿润、脱落、脊柱后凸、偏瘫、发抖和打转等体征,症状持续。约16dpi时小鼠以上症状明显加重并开始出现死亡。大鼠模型感染期间观察只发现出现脱毛症状,其它在小鼠模型身上出现的发病症状不明显。1.2幼虫相关结构观察1.2.1电镜观察结果21dpi解剖采集两种宿主脑中的幼虫,通过扫描电镜观察了解不同宿主脑内虫体结构特征：(1)通过扫描电镜观察虫体头部其口部结构及周围感觉乳突、化学感受器发现两种宿主脑内幼虫均发育完全,正常宿主(SD大鼠)和非正常宿主脑内幼虫(BABL/c和KM两种小鼠)经观察和统计学分析以上结构未见统计学差异(PO.05)；(2)扫描电镜下观察两种宿主脑内虫体尾部结构显示：SD大鼠以及BABL/c和KM两种小鼠尾部结构完整,尾部褶皱明显,雌虫肛门和阴门开口及雄虫交合伞均清晰可见,统计学分析未见差异(PO.05)。(3)幼虫头部其他结构观察：两种感染宿主脑内幼虫头部结构发育均已基本成熟与广州管圆线虫成虫头部扫描电镜结构相似；1.2.2光镜观察21dpi解剖采集两种宿主脑中的幼虫,与幼虫发育程度相关的结构如幼虫体长体、宽及咽肠比例并进行统计学分析认为：两种宿主脑内幼虫在虫体长度、宽度以及咽肠比例差异具有统计学意义(P＜0.001),大鼠脑内幼虫发育程度较小鼠脑内幼虫发育程度高。两种小鼠脑内幼虫体长、体宽及咽肠比例进行比较发现无统计学差异(PO.05),而咽长具有差异(P＜0.05)。2.广州管圆线虫排泄分泌物相关蛋白酶谱分析2.1大鼠和小鼠脑内21dpi幼虫蛋白质谱大致相同,小鼠ESP的主要条带比大鼠ESP的主要条带多,大小鼠的条带具有明显差异性。2.2明胶酶谱进一步比较两种分泌蛋白在功能上的差异,结果出现了明显的反应条带,但是大鼠ESP在Mr35000和Mr32000处较小鼠ESP反应条带更为明显。2.3进一步明胶酶谱分析,大鼠ESP在Mr40000～Mr35000处水解程度较小鼠ESP强,用不同蛋白酶抑制剂处理两种样品,发现大鼠ESP和小鼠ESP经EDTA处理后的样品在Mr40000-Mr35000水解区域均有所减弱,大鼠ESP条带的减弱程度更为明显。3.LESA对早期广州管圆线虫感染的诊断价值将收集浓缩的分泌蛋白作为抗原包被酶标板,然后将该酶标板以及全虫抗原酶标板分别与免疫小鼠血清反应。检测不同时间点IgG和IgM变化趋势显示感染后第5天抗体水平达到高峰且高峰可持续到第10天,之后峰线出现波动；LESA感染组IgG组内比较发现第10天时IgG水平较第15天和第21天时高,且差异具有统计学意义；两种抗原与广州管圆线虫病人血清反应阳性率检测显示：AWA检测敏感性较LESA稍高；同时AWA与其他寄生虫抗原存在交叉反应性,而LESA交叉反应性不明显,其中急性血吸虫病人血清,裂头蚴病人血清,粪类圆线虫病人血清检测均未出现阳性反应,说明LESA可以提高检测的特异性,作为抗原检测方法对早期诊断具有良好的指导作用。结论1.大鼠和小鼠脑内幼虫口部结构及周围感觉乳突、化学感受器未见差异；但二者的发育程度具有统计学差异。2.大鼠和小鼠脑内幼虫体外培养分泌的蛋白与明胶酶谱存在明显差异。3.小鼠脑内幼虫分泌蛋白用于广州管圆线虫抗体检测时具有较高的敏感性和特异性,具有潜在的早期诊断和疗效考核价值。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R383.1
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本文编号：1652402