新型生物传感器的研究及其在核酸和蛋白质检测方面的应用

发布时间：2018-03-24 16:24

本文选题：芘探针　切入点：单核苷酸多态性　出处：《吉林大学》2011年博士论文

【摘要】：核酸和蛋白质是生物体赖以生存的基本物质,也是生命活动的物质基础。核酸存储和传递遗传信息并指导蛋白质的合成,是生命的缔造者。蛋白质负责实现各种生物功能,是生命活动的主要表现者。随着生命科学和生物医学的发展,研究疾病与核酸、蛋白质的关系逐渐成为热点。本质上说,基因突变是疾病的出现的诱因。DNA发生突变,转录出错误的遗传信息,导致表达出来的蛋白质功能异常,最终引发疾病。那么,预防和诊断疾病的方法就变得尤为重要。核酸是否出现突变,蛋白含量是否超出正常范围,这些指标都有助于我们监控疾病。因此,建立新方法来检测核酸和蛋白质是科研工作者的首要任务。基于上述考虑,本论文主要就是探索新的生物传感方法,用于DNA和蛋白质的定性、定量分析。生物传感器是利用生物活性物质(核酸、蛋白质、酶、细胞等)之间的分子识别功能,把被检测的靶物质的浓度变化、构象变化等微观的生物过程转变成可视的、可量化的物理化学信号(如电信号、荧光信号),从而达到检测靶分子(核酸、蛋白质等)的目的。设计生物传感器,重点是如何选择最适合的与待测物特异性识别的敏感元件,这直接决定传感器选择性好坏和灵敏度高低,抗原-抗体、酶-基质和核酸适体-蛋白质都是很好的候选组合。生物传感器的种类很多,比如酶传感器、葡萄糖传感器、免疫传感器等。生物传感方法作为生物技术中一种优越的监测手段和检测方法,具有很好的应用价值和发展空间。本课题主要研究了基于荧光探针和核酸适体的生物传感器,并应用到核酸和蛋白质的分析与检测方面。为此主要开展了以下几个方面的工作： 1.主要研究小分子荧光探针(芘衍生物)与核酸分子的相互作用,分别考察了核酸浓度、核酸长度、核酸构象(单链、双链)对芘探针激基缔合物荧光的影响。将核酸与芘探针之间作用的结果转化为可视的荧光信号。旨在建立一种基于非标记(label-free)荧光探针的生物传感器,用于探针核酸的存在以及核酸的不同构象。 2.进一步研究芘荧光探针与正常和突变DNA分子的相互作用,引入一种单链核酸酶(nuclease SI),将因突变产生的单链DNA酶解成单核苷酸,而正常DNA免于酶切。酶切反应后造成正常与突变核酸长度的差异,将这种长度差异转化为芘探针激基缔合物荧光差异。本实验旨在建立一种DNA热力学分析和酶切反应的非标记(label-free)荧光生物传感器,用于检测核酸中单个碱基突变,即单核苷酸多态性分析。 3.主要研究蛋白质与核酸适配体以及分子信标之间的相互作用。目的蛋白与单链结合蛋白(SSB)都能结合核酸适配体,但是,SSB竞争不过目的蛋白,被竞争下来的SSB与分子信标结合使其荧光恢复。本实验旨在发展一种基于核酸适体-蛋白质识别作用和蛋白质竞争取代机制的生物传感器,借助分子信标作为报告探针,用于分析蛋白质含量,比如唾液中溶菌酶的含量。 4.主要研究单链结合蛋白(SSB)与分子信标的相互作用及SSB的循环过程。微量的SSB蛋白与分子信标结合后产生的荧光几乎看不到,但是,当加入与分子信标末端互补的锁定核酸(LNA)引物、聚合酶和dNTP,随后的聚合反应将把结合在信标上的SSB竞争下来,SSB再继续打开剩余的分子信标,如此循环直到打开所有分子信标,并产生明显可见的荧光信号。本实验旨在发展一种基于分子信标探针及酶聚合反应的荧光信号放大的生物传感器,用于分析微量的单链结合蛋白(SSB)。在进行核酸识别与检测研究中,我们选择一种芘衍生物作为荧光探针作为给信号的物质,这种芘探针本质是一种多聚阳离子,能够在DNA磷酸骨架(带负电荷)表面自组装并集聚产生激基缔合物荧光(excimer emission)。深入研究发现,核酸的构象、核酸的浓度、核酸的长度直接影响到激基缔合物荧光的产生和强度大小。基于这些性质,我们设计了检测点突变的荧光探针生物传感器。在进行蛋白质识别与检测研究中,我们的研究思路的是利用核酸适配体与蛋白质特异性识别的原理来定量分析蛋白质。其中,选择了分子信标这种特殊的“光开关”作为给信号的报告探针。我们还引入了一种能循环使用的单链结合蛋白(SSB), SSB与分子信标的结合能够使其猝灭的荧光信号得以恢复。根据这些原理,设计了基于溶菌酶-SSB竞争取代和SSB循环-分子信标信号扩增的实验,结果表明,该方法可以用于SSB蛋白检测。通过系统全面的考察,我们已经建立了上述四种生物传感器,并且应用到了核酸识别、点突变检测、蛋白质定量等方面。荧光探针法体现了免标记、成本低、快速的优点。基于核酸适体的方法体现了高特异性和选择性的优点。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R341

【参考文献】