梅毒螺旋体粘附蛋白Tp0155、Tp0483通过激活NF-κB诱导人巨噬细胞产生炎性细胞因子

发布时间：2018-03-26 04:51

  本文选题：梅毒螺旋体　切入点：Tp0155　出处：《南华大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum, Tp)重组粘附蛋白Tp0155和Tp0483潜在的诱导巨噬细胞(Mφ)产生炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的能力;探讨Tp0155和Tp0483诱导产生IL-6、IL-1β和TNF-α是否与NF-κB信号转导通路有关。 方法:通过Genbank获取所选Tp0155和Tp0483蛋白的基因序列,以Tp Nichols株全基因组DNA为模板,PCR扩增目的片段,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中构建重组质粒pET28a(+)/Tp0155和pET28a(+)/Tp0483,经PCR、双酶切、测序鉴定后转化至表达宿主菌E.coli Rosseta中,IPTG诱导蛋白表达。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度;Detoxi-Gel?内毒素去除胶去除重组蛋白中的内毒素。用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞转化为Mφ,并用Tp0155和Tp0483重组蛋白刺激Mφ,采用ELISA双抗体夹心法检测Mφ分泌炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平;提取Tp0155和Tp0483处理后的Mφ的总蛋白,Western blot检测Mφ总蛋白中κB抑制蛋白(IκB)的降解情况。用NF-κB特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预处理Mφ30 min,再以Tp0155和Tp0483重组蛋白刺激Mφ,分析其对IL-6、IL-1β和TNF-α产生的影响。 结果: PCR成功扩增Tp0155和Tp0483出基因目的片段,重组质粒经酶切和测序鉴定证实与Genbank上登录序列完全一致;在IPTG诱导下,重组表达菌分别表达了一相对分子量约为46kDa(Tp0155)和47kDa(Tp0483)的重组蛋白,目的蛋白在菌体细胞内以可溶性和包涵体形式存在,包涵体蛋白为主要存在形式,经Ni-NTA亲和纯化后,纯度在95%以上;内毒素去除胶处理重组蛋白后,鲎实验检测内毒素含量小于0.04EU/mL;0.5～5μg/mL Tp0155和0.5～7μg/mL Tp0483重组蛋白均能通过剂量依赖方式诱导PMA转化后的Mφ产生IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子的产量都随着蛋白浓度的增加而增加,到达某个最高值后逐步减少。Tp0155的浓度在5μg/mL时,TNF-α的量达到高峰,为(963.85±29.66) pg/mL, Tp0155的浓度在7μg/mL时,IL-1β和IL-6的量达到高峰;Tp0483的浓度在5μg/mL时,TNF-α、IL-1β和IL-6的量同时达到高峰。且分泌水平呈一定的时间依赖性:炎症因子的产量随着时间延长而增加,分别在不同时间达到最高值,TNF-α在刺激24h后达到高峰,而IL-6和IL-1β为48h后达到高峰。Western blot结果显示,Tp0155和Tp0483均能诱导Mφ内IκB降解;经PDTC处理后,Tp0155和Tp0483分别能使Mφ的IL-6产生量降至53%和49%;IL-1β产生量降至52%和54%,TNF-α产量分别降至57%和58%。 结论: 1. Tp0155和Tp0483重组蛋白能通过时间和剂量依赖方式诱导Mφ产生IL-6、IL-1β和TNF-α。 2. Tp0155和Tp0483重组蛋白刺激Mφ后能诱导其细胞内IκB降解。 3. Tp0155和Tp0483重组蛋白刺激Mφ产生IL-6、IL-1β和TNF-α可能与NF-κB的激活有关。
[Abstract]:Aim: to investigate the ability of Treponema pallidum (TP) recombinant adhesion protein Tp0155 and Tp0483 to induce macrophage M 蠁) to produce inflammatory cytokines IL-6, IL-1 尾 and TNF- 伪, and to explore whether the production of IL-6T IL-1 尾 and TNF- 伪 by Tp0155 and Tp0483 is related to NF- 魏 B signal transduction pathway. Methods: the gene sequence of Tp0155 and Tp0483 protein was obtained by Genbank. The target fragment was amplified by PCR using the whole genome DNA of TP Nichols strain as template. The fragment was subcloned into the prokaryotic expression vector pET28a (pET28a) to construct the recombinant plasmids pET28a( P / Tp0155 and pET28a / Tp0483). SDS-PAGE and Western blot were used to analyze and identify the expression of recombinant protein, which was purified by affinity chromatography with Ni-NTA column. The protein concentration was determined by Detoxi-Gel? Endotoxin removal was used to remove endotoxin from recombinant protein. THP-1 cells were induced to be transformed into M 蠁 by phorbol ester (PMA). M 蠁 was stimulated by Tp0155 and Tp0483 recombinant protein. The levels of IL-6- 尾 and TNF- 伪 secreted by M 蠁 were detected by ELISA double antibody sandwich method. The degradation of 魏 B inhibitor I 魏 B in M 蠁 was detected by Western blot after Tp0155 and Tp0483 treatment. M 蠁 was pretreated with NF- 魏 B specific inhibitor, pyrrolidine dithiocarbamate, for 30 min, and then stimulated by Tp0155 and Tp0483 recombinant proteins. M 蠁, to analyze its effect on IL 6, IL 1 尾 and TNF- 伪 production. Results: the target fragments of Tp0155 and Tp0483 were successfully amplified by PCR, and the recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease digestion and sequencing. A recombinant protein with a relative molecular weight of about 46kDa (Tp0155) and 47kDa (Tp0483) was expressed respectively. The target protein existed in the form of soluble and inclusion bodies in the cells, and the inclusion body protein was used as the main existing form. The protein was purified by Ni-NTA affinity. The purity is more than 95%. Tachypleus test showed that endotoxin content was less than 0.04 EUP / mL 0.5 渭 g/mL Tp0155 and 0.5 渭 g/mL Tp0483 recombinant protein could induce the production of IL-6 IL-1 尾 and TNF- 伪 inflammatory factors in M 蠁 transformed by PMA in a dose-dependent manner. When the concentration of .Tp0155 gradually decreased at 5 渭 g/mL, the amount of TNF- 伪 reached its peak. For 963.85 卤29.66) PG / mL, the concentrations of IL-1 尾 and IL-6 reached the peak at 7 渭 g/mL and the concentrations of Tp0483 reached the peak at 5 渭 g/mL, and the levels of TNF- 伪 and IL-1 尾 and IL-6 reached the peak at 5 渭 g/mL, and the secretion level was in a time-dependent manner: the production of inflammatory factors increased with time. The peak value of TNF- 伪 was reached at different time after 24 h stimulation, while that of IL-6 and IL-1 尾 reached the peak at 48 h. The results showed that Tp0155 and Tp0483 could induce the degradation of I 魏 B in M 蠁. After treated with PDTC, Tp0155 and Tp0483 could reduce the IL-6 production of M 蠁 to 53% and IL-1 尾 to 52% and 54 TNF- 伪 to 57% and 58%, respectively. Conclusion:. 1. The recombinant protein of Tp0155 and Tp0483 could induce the production of IL-6 IL-1 尾 and TNF- 伪 by M 蠁 in a dose-and time-dependent manner. 2. I 魏 B degradation was induced by stimulation of M 蠁 by Tp0155 and Tp0483 recombinant proteins. 3. The production of IL 6, IL 1 尾 and TNF- 伪 by M 蠁 stimulated by Tp0155 and Tp0483 recombinant proteins may be related to the activation of NF- 魏 B.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

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本文编号：1666410