肠出血性大肠杆菌O157:H7 TccP蛋白与宿主细胞IRTKS蛋白的相互作用研究

发布时间：2018-03-28 08:19

  本文选题：EHEC　切入点：O157:H7　出处：《第三军医大学》2011年硕士论文

【摘要】：背景 肠出血性大肠杆菌(enterohaemorragic Escherichia coli,EHEC) O157:H7为重要的人畜共患传染病原,其感染具有暴发流行、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗加剧病情等特点,同时它还可作为细菌武器与生物恐怖战剂的原料,已成为全球性的公共卫生问题。加强其致病机理的研究对提高由该菌引起的流行病、生物恐怖的预防和处理能力,具有重要的理论指导意义。 病原体和宿主的相互作用是决定感染的关键。EHEC O157:H7主要通过紧密粘附素intimin与其在上皮细胞膜表面的受体Tir(translocated intimin receptor)结合,粘附和定植于宿主细胞表面,引起特异性粘附擦拭损伤(attaching and effacing lesions, A/E lesions),同时分泌强烈致死性毒素志贺毒素(shiga toxin),最终引起宿主发生腹泻、出血性肠炎及溶血性尿毒综合征等严重并发症。A/E损伤形成是一系列效应分子参与的信号传导过程,涉及包括细菌和宿主细胞的多种效应分子间的相互作用。TccP(Tir Couple Cytoskeleton Protein,内膜素受体偶联细胞骨架蛋白)是近年研究新发现的EHEC O157:H7致病分子,它经EHEC O157:H7的Ⅲ型分泌系统转导入宿主细胞内,发挥致病作用。TccP含有富含脯氨酸的重复片段,该重复片段为与宿主细胞IRTKS效应蛋白SH3结构域相互作用的功能单元。EHEC O157菌株之间TccP的重复片段存在差异,这种差别可能与A/E损伤的形成和致病性有关。 前期课题组分离鉴定了一株弱毒的EHEC O157:H7,其具有3个脯氨酸富集重复片段TccP,介导A/E损伤能力下降[1]。为进一步阐明其致病的物质基础,本研究拟在体外直接观察TccP的3个脯氨酸富集重复片段TccP(3R)和IRTKS蛋白SH3结构域的相互作用。 目的 1.采用DNA重组技术分别克隆表达TccP蛋白的3个脯氨酸富集重复片段(TccP(3R))和IRTKS蛋白SH3结构域(SH3(IRTKS))。 2.利用Tricine-SDS-PAGE、Native-PAGE和免疫印记以及凝胶过滤层析和晶体培养分析TccP(3R)与SH3(IRTKS)在体外的相互作用。 方法 1.重组表达载体的构建 通过PCR技术扩增TccP(3R)和SH3(IRTKS)基因片段,分别连接于原核表达质粒pET28a(+)和pET30a(+)获得重组质粒。酶切、测序鉴定正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组工程菌。 2.重组蛋白的表达和纯化 重组工程菌经IPTG诱导后,超声破菌,Tricine-SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。TccP(3R)蛋白依次经过Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析;SH3(IRTKS)蛋白依次经过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析,进行蛋白纯化。纯化后TccP(3R)和SH3(IRTKS)蛋白经蛋白超滤离心管浓缩,BCA法测定蛋白浓度。 3. TccP(3R)与SH3(IRTKS)体外结合实验 根据TccP(3R)和SH3(IRTKS)的氨基酸序列,通过DNAStar软件预测分子量。根据分子量和已测定的质量浓度,换算摩尔浓度。将TccP(3R)和SH3(IRTKS)蛋白按照摩尔比1:10混合进行体外结合实验。 4.体外结合实验结果的分析 通过Tricine-SDS-PAGE、Native-PAGE和免疫印记对体外结合实验得到的混合物进行分析。 利用凝胶过滤层析对体外结合实验得到的混合物进行分析。蛋白标准品、TccP(3R)、SH3(IRTKS)以及体外结合实验得到的混合物分别通过凝胶过滤层析Superdex75 10/300柱,获得出峰体积。根据标准品蛋白出峰体积和其已知的分子量求得Kav和LogMw值,利用Kav和LogMw值算出回归直线方程式,将TccP(3R)、SH3(IRTKS)及其混合物中蛋白的出峰体积代入方程式,算出各蛋白的分子量。求TccP(3R)与SH3(IRTKS)的分子量之和,通过与TccP(3R)- SH3(IRTKS)蛋白复合体分子量的比较,估算TccP(3R)与SH3(IRTKS)相互结合的比例。 5. TccP(3R)-SH3(IRTKS)复合体的晶体学研究 将体外结合实验得到的混合物进行凝胶过滤层析,以获得纯化的TccP(3R)- SH3(IRTKS)蛋白复合体。应用Hampton Research公司的晶体初筛试剂盒进行蛋白复合体结晶条件的初步筛选。 结果 1.酶切、DNA测序鉴定结果证实成功构建了pET28a(+)-TccP(3R)和pET30a(+)-SH3(IRTKS)重组表达载体。 2.重组工程菌经IPTG诱导表达后,超声破菌并离心,上清和沉淀经Tricine-SDS-PAGE分析,结果表明:TccP(3R)、SH3(IRTKS)均主要存在于上清中,目的蛋白经纯化后纯度大于98%。 3.将纯化的TccP(3R)和SH3(IRTKS)体外混合,Tricine-SDS-PAGE分析结果显示:出现两条分子量大小分别与TccP(3R)和SH3(IRTKS)相符的条带;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果表明:原TccP(3R)条带消失,出现一条新的蛋白带;以兔抗TccP抗体为一抗进行免疫印迹检测,结果显示:新条带能够与抗TccP抗体反应而显色。 4.根据蛋白标准品的凝胶过滤层析出峰体积和分子量,通过回归分析得到直线方程式:Kav=1.476608-0.27976*LogMw (R2=0.926). 5. TccP(3R)、SH3(IRTKS)及两者复合体的凝胶过滤层析出峰体积分别为12.0ml、14.5ml和11.4ml,根据出峰体积求得分子量分别为24238、6698和33002。根据TccP(3R)、SH3(IRTKS)及两者复合体分子量的关系,估算TccP(3R)与SH3(IRTKS)的结合比例约为1:1。 5.通过凝胶过滤层析获得了TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白复合体。 结论 1.采用基因工程技术高效表达了可溶性TccP(3R)、SH3(IRTKS)重组蛋白,并通过纯化获得了高纯度的目的蛋白。 2. TccP(3R)与SH3(IRTKS)蛋白在体外能发生相互作用,并形成蛋白复合体。 3. TccP(3R)与SH3(IRTKS)相互结合的摩尔比约为1:1。 4.通过体外结合实验和凝胶过滤层析,能够制备TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白复合体。 综上所述,含3个重复片段的TccP蛋白能够与IRTKS蛋白按照摩尔比1:1相互结合后形成蛋白复合体,而且,通过制备TccP(3R)-SH3(IRTKS)蛋白复合体,为进一步通过晶体学技术研究两者的相互作用机制奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

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本文编号：1675504