重组牛γ-干扰素的表达、纯化、鉴定及其抗体制备

发布时间：2018-03-29 20:40

本文选题：重组牛IFN-γ　切入点：单克隆抗体　出处：《中国农业科学院》2012年硕士论文

【摘要】：牛结核病（bovine tuberculosis）是一种人畜共患的慢性消耗性传染病，主要由牛分枝杆菌(Myeobacterium bovis)感染所引起，可以通过病畜传染给人或其他动物。该病不仅严重阻碍了我国奶牛养殖业的发展，也严重危害着人类的健康。国际上普遍采用“检疫-扑杀”的措施进行该病的防控。有关牛结核病的诊断方法有很多种，主要以提纯牛结核菌素（PPD）皮内变态反应试验为主，但该方法在判定结果时存在一定的主观性，易出现假阳性和假阴性，为结核病的防控带来了诸多不利。γ-干扰素(IFN-γ)释放试验是牛结核病体外免疫学检测新方法，该方法操作简单、特异性和灵敏性高，并且为非侵入性检测，可以重复多次检测，检测结果更为客观、可靠，在澳大利亚等多个发达国家推行使用。目前，国内也开始小范围使用牛分枝杆菌IFN-γ ELISA检测试剂盒，但由于所使用的试剂盒主要依赖进口，价格昂贵，严重阻碍了其在临床检测中的应用。鉴于以上现实考虑，本研究从以下四个方面进行了相关探究，为进一步建立牛IFN-γ免疫学检测方法提供基础。 1.牛IFN-γ的原核表达及鉴定用RT-PCR方法扩增出牛IFN-γ的基因片段，并成功构建原核重组质粒pET-32a(+)-IFN-γ和pGEX-6p-1-IFN-γ，将重组质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，经0.5mM IPTG诱导后成功表达重组牛IFN-γ，，分别命名为rIFN-γ-His和rIFN-γ-GST。SDS-PAGE电泳结果显示，两种重组蛋白均为可溶性表达，大小分别为36ku、43ku。Western blotting及ELISA分析结果显示，rIFN-γ-His和rIFN-γ-GST具有良好的免疫原性。MDBK/VSV抗病毒试验结果显示，rIFN-γ-His和rIFN-γ-GST具有一定的抗病毒活性，rIFN-γ-His抗病毒活性为4056IU/mg，rIFN-γ-GST抗病毒活性为5078IU/mg。 2.牛IFN-γ的杆状病毒表达及鉴定以pET-32a(+)-IFN-γ为模板扩增出牛IFN-γ的基因片段，定向克隆至pFastBacTMHTA中构建重组质粒pFastBacTMHTA-IFN-γ，转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组穿梭质粒Bacmid-IFN-γ，转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒Bac-IFN-γ。应用sf21昆虫细胞悬浮培养技术大量表达目的蛋白，命名为rIFN-γ-Bac。SDS-PAGE电泳结果显示，rIFN-γ-Bac为可溶性表达。Western blotting分析结果显示，重组牛IFN-γ被进行了有效的糖基化修饰，包括大小分别为16.8ku、20.8ku和22ku的三种重组蛋白。BOVIGAM牛分枝杆菌IFN-γ ELISA检测试剂盒检测结果显示，rIFN-γ-Bac有良好的免疫原性。MDBK/VSV抗病毒试验结果显示，rIFN-γ-Bac具有很高的抗病毒活性，抗病毒活性为1.05×10~5IU/mg。蛋白质谱鉴定结果显示，所获得的6段多肽序列与牛IFN-γ中的氨基酸序列完全匹配，进一步证实了所表达的rIFN-γ-Bac确为牛IFN-γ。 3.抗牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定用纯化后的rIFN-γ-Bac免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，在PEG4000融合剂的作用下进行小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合，经筛选后获得1A3、2A7、4A5、3E4、3E5、2G3共6株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明，1A3、4A5、2G3属于IgG2b型，3E5属于IgG1型，2A7、3E4属于IgM型。间接ELISA检测结果显示，6株单克隆抗体均可以特异性的识别rIFN-γ-His、rIFN-γ-GST和rIFN-γ-Bac。间接ELISA检测腹水效价均达到1:10~5以上，经HiTrap~(TM) protein G HP亲和层析柱纯化出高纯度的鼠抗牛IFN-γ单克隆抗体。以PPD刺激牛PBMC产生牛IFN-γ，将细胞固定后进行间接免疫荧光试验，结果显示1A3、2A7、3E4、3E5能与刺激后的细胞结合产生特异性荧光，表明1A3、2A7、3E4、3E5可以结合天然牛IFN-γ。 4.抗牛IFN-γ多克隆抗体的制备及鉴定用纯化后的rIFN-γ-His、rIFN-γ-GST分别免疫新西兰白兔，收集血清后用HiTrap~(TM) protein GHP亲和层析柱纯化出高纯度的抗牛IFN-γ多克隆抗体。间接ELISA方法测定多抗的效价可达到1:4×10~5以上。以PPD刺激牛PBMC产生牛IFN-γ，将细胞固定后进行间接免疫荧光试验，结果显示多抗能特异性结合天然牛IFN-γ。用纯化后的多抗包被ELISA板，联合BOVIGAM试剂盒中的HRP标记鼠抗牛IFN-γ单克隆抗体，采用双抗体夹心法检测PPD刺激的结核病阳性牛血浆，结果显示所制备的多抗能捕获处理血浆中的天然牛IFN-γ，具有良好的亲和力和较高的特异性。通过优化试验确定了多抗的最佳包被浓度为5μg/mL，最佳封闭剂为10%FBS，最佳显色时间为25min。综上所述，我们成功表达并纯化出具有良好反应原性的重组牛IFN-γ， rIFN-γ-Bac抗病毒生物学活性最佳。在此基础上我们进行了牛IFN-γ单克隆抗体和多克隆抗体的初步制备及鉴定，所获得的多克隆抗体对天然牛IFN-γ具有良好的亲和力和较高的特异性。为进一步建立牛IFN-γ免疫学检测方法奠定了基础。
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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378;S855.2

【参考文献】