兔同种异体脱钙骨复合骨髓间充质干细胞体外培养的成软骨观察

发布时间：2018-04-02 13:22

  本文选题：骨髓间充质干细胞　切入点：生长因子　出处：《安徽医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的1.探讨体外进行兔骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、培养和鉴定的方法,为下一步组织工程软骨构建奠定基础。2.研究兔骨髓间充质干细胞(BMSC)复合同种异体脱钙骨(DBM)在诱导液刺激下体外培养形成软骨。 方法1.采用同源雄性新西兰幼兔(4～6周龄)全骨髓贴壁筛选法培养原代BMSC,传代至第二代细胞时部分标本行流式细胞表型鉴定,第三代细胞融合至约80%时培养基中加入成软骨诱导液:含转化生长因子(Transforming Growth Factor,TGF)-β1 10ng/ml、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)-Ⅰ20ng/ml、维生素C 50ng/ml,取诱导14d后以及诱导前的细胞进行爬片并做Ⅱ型胶原免疫组化。2.根据Urist提供的方法制作DBM,用电镜观察DBM内部结构。3.将诱导后的BMSC种植于DBM支架进行体外培养,于4、8、12周分别取材,行大体形态观察并制石蜡切片行苏木素伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)、甲苯胺蓝(Toluidine Blue,TB)染色、Masson染色、Ⅱ型胶原免疫组化等组织学观察。 结果1.本实验方法分离和培养的MSCs形态特征明显,均呈梭形,原代培养10～14天细胞融合约90%,增殖传代的细胞6～7天可达90%融合。所培养的细胞经流式细胞仪鉴定,CD44(+),CD34(-)。MSCs经定向诱导后表现出软骨细胞的特性。2.制备得到的DBM为三维立体疏松多孔的海绵样结构,电镜显示DBM内部的孔隙结构并相互交通。3.诱导后的BMSCs与DBM复合培养12w后,取出行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组化观测:HE染色见软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞排列无序,周围基质包绕;Masson染色见阳性,见软骨细胞排列无序;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞胞浆和外基质中出现棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色阳性。 结论1.应用贴壁细胞筛选法可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,体外给予TGF-β1和IGF-Ⅰ可促进MSCs增殖和成软骨分化;2.MSCs与同种异体DBM结合后可在体外成功培养出组织工程软骨;3.作为“同种异体骨复合外周血干细胞关节腔内培养工程软骨”的系列研究的一部分,本实验为过渡到下一阶段“体内成软骨研究”奠定了良好基础,并为后续研究提供了良好的支撑和对照。
[Abstract]:Objective 1. To investigate the method of isolation, culture and identification of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) in vitro. To lay the foundation for the further construction of tissue engineered cartilage. To study the formation of cartilage in rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) combined with allogeneic decalcified bone marrow (DBM) stimulated by induction fluid in vitro. Methods 1. Primary BMSCs were cultured by the method of bone marrow adherent screening at the age of 4 ~ 6 weeks in the homologous male New Zealand rabbits. The phenotypes of BMSCs were identified by flow cytometry in some samples from passage to the second generation of cells. 2. When the third generation cells were fused to the medium of about 80th generation, the chondrogenic inducer was added to the medium: TGF- 尾 1 10 ng / ml containing transforming Growth factor- 尾 1 10 ng / ml, insulin-like Growth factor- 鈪，

本文编号：1700585