可溶性DC-SIGN对T细胞免疫调节功能的初步研究

发布时间：2018-04-05 04:37

本文选题：可溶性DC-SIGN　切入点：夹心ELISA　出处：《南方医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：二十几年前,天然免疫还被认为是一个退化的免疫机制,极少受到免疫学家的关注,而获得性免疫凭借其高特异性的抗原识别系统及复杂的分子与细胞间相互作用受到大家的追捧。近十几年来,天然免疫越来越受到人们的青睐。天然免疫系统是由多种识别及效应分子组成的复杂的网络结构,它们协同作用,构成机体抗感染的第一道防线；并感受危险信号,指导获得性免疫应答的性质和强度。作为机体免疫防御的第一道防线,天然免疫远比我们先前认为的更重要、更复杂、更具泛特异性而致其识别谱更广；越来越多的证据表明天然免疫对于获得性免疫应答具有重要的指导作用。在这个重要的防御系统中,凝集素家族分子扮演着不可或缺的角色。树突状细胞特异性的结合细胞间黏附分子3的非整合素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN, CD209)属于C型凝集素超家族成员,是一种Ⅱ型跨膜蛋白,分子量为44KD,由404个氨基酸组成。从C端至N端依次为糖识别域(carbohydrate recognition domain, CRD)、颈区、跨膜区和胞浆区。DC-SIGN选择性表达于树突状细胞(dendritic cell, DC)、巨噬细胞及激活后的B细胞,多种组织如滑液、胎盘、淋巴组织、皮肽真皮层、宫颈上皮下区已检测出DC-SIGN。DC-SIGN属于凝集素超家族中C型凝集素家族的成员,其CRD可以钙离子依赖的方式特异性结合多种病原体糖类抗原,包括甘露聚糖、岩藻糖等。DC-SIGN之所以被人们重视,是由于其作为膜受体,介导了DC对抗原的摄取、与内皮表面黏附、迁移与成熟,并与初始T细胞粘附,在触发T细胞应答中发挥着重要作用。此外,DC-SIGN还参与多种病原体如HIV、HCV及结核分枝杆菌感染细胞及其在细胞间的传播。近年来,本课题组一直在研究甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)的免疫调节作用,但它是一个存在于血清中的可溶性模式识别受体。DC-SIGN与MBL同属于C型凝集素家族。那么,DC-SIGN是否存在可溶性形式即sDC-SIGN,其是否也能直接调节获得性免疫应答呢? 本研究中,我们原核表达了sDC-SIGN,建立了sDC-SIGN双夹心ELISA检测体系,收集血浆样品,并对收集到的血浆样品进行检测,初步证实在人体血浆中确实存在sDC-SIGN。进一步,我们从细胞增殖,细胞因子分泌及细胞活化三个层面研究了sDC-SIGN对T细胞免疫调节功能的影响。一、sDC-SIGN双夹心ELISA检测体系的建立及血浆样本的检测前期本科室已经制备出抗sDC-SIGN两株单抗1C6和4H3,进一步我们分别通过ELSIA. WesternBlot同商品化的anti-CD209(anti-DCSIGN)做了比较,鉴定两株单抗的敏感性与特异性。我们原核表达的sDC-SIGN由糖识别域即CRD区和颈区两部分组成,在糖结合实验中1C6与sDC-SIGN的结合力明显大于4H3,据此推测4H3识别的位点很靠近CRD区。为了得到灵敏度较高的ELISA检测体系,我们分别将两株单抗进行生物素标记,通过优化实验条件,最后确定以单抗1C6为捕获抗体,即包被抗体,以标记生物素的4H3为检测抗体,并进行了最佳工作浓度,反应时间及温度的选择与确定。接下来,我们收集到219例普通人群血浆样本,106例内分泌失调人群血浆样本进行检测。根据检测结果分析,人体中确实有sDC-SIGN的存在。进一步,我们对sDC-SIGN的免疫调节用进行了研究。二、sDC-SIGN对T细胞免疫调节功能的研究研究发现,与DC-SIGN同属于C型凝集素超家族的成员SP-A,SP-D对天然免疫和获得性免疫发挥调节功能。研究表明, SP-A,SP-D能以IL-2依赖及IL-2非依赖两种方式,抑制T细胞的增殖,调节T细胞免疫应答。前期实验我们已经检测到人体血浆中存在sDC-SIGN,存在即有意义!!目前很少有DC-SIGN免疫调节作用的有关报道,其对T淋巴细胞直接调节作用的报道更是从未问闻。根据胶凝素家族各成员之间的结构和功能同源性,我们推测sDC-SIGN很可能对获得性免疫也有影响。基于本室的前期工作sDC-SIGN原核表达载体的构建,我们首先原核表达了sDC-SIGN蛋白,然后采用密度梯度离心法自成年健康志愿者外周血分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC),并采用MACS负选法纯化CD3+T淋巴细胞。分别用非特异性刺激剂刀豆蛋白A(ConA)和特异性刺激剂anti-CD3/CD28单抗活化CD3+T淋巴细胞,收集培养上清,进行细胞因子IL-2, IFN-γ, IL-10, IL-6及IL-17a的检测。另外采用CFSE法,分析sDC-SIGN对T细胞的增殖的影响,同时流式细胞术检测T细胞早期活化标志CD69的表达情况。结果显示：sDC-SIGN可抑制Con A及anti-CD3/anti-CD28单抗所诱导的T细胞增殖,对CD8+T细胞增殖的抑制作用尤其显著；能下调由Con A及anti-CD3/anti-CD28单抗所诱导的T细胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-10及IL-17A,而对其IL-6分泌则呈现一定的促进作用。资料提示,sDC-SIGN可能通过改变细胞因子之间的动态平衡进而影响T细胞的分化。我们还发现sDC-SIGN能下调ConA诱导的T细胞早期活化标志CD-69的表达。这都为进一步阐明sDC-SIGN的免疫调节功能提供了证据,丰富了天然免疫指导获得性免疫的内容。三、sDC-SIGN对T细胞免疫调节功能的机制初探前面工作我们已经证实,可溶性DC-SIGN存在于人体血浆中并且能够影响T细胞的免疫应答。进一步,我们想知道sDC-SIGN可能通过哪部分与T结合。我们重组表达的sDC-SIGN由CRD区及颈区两部分构成。膜型DC-SIGN的CRD区可以以钙离子依赖的方式结合特定的糖类抗原,颈区主要参与被结合的糖寡聚化并调节糖的特异性,而有利于DC-SIGN与糖配体的结合。Cell ELISA结果显示,在没有Ca2+参与的条件下sDC-SIGN与T细胞的结合能力强于有Ca2+参与的的情况。我们在细胞培养时加入Ca2+检测细胞因子分泌的情况,发现Ca2+的参与能够逆转sDC-SIGN对T细胞分泌IFN-γ、IL-10及IL-17A的抑制作用,同样sDC-SIGN对T细胞分泌IL-6的促进作用也得到一定程度的抑制。这提示我们sDC-SIGN可能不是通过CRD区结合T细胞发挥作用,或者sDC-SIGN的CRD区与其配体的结合可以不依赖Ca2+的存在。另外,我们在细胞培养时加入rhIL-2结果发现,rhIL-2能够逆转sDC-SIGN对T细胞分泌IFN-γ的抑制作用,由此推断,sDC-SIGN可能通过IL-2依赖的方式抑制T细胞的增殖。综上所述,我们检测到人体中存在可溶性的DC-SIGN (sDC-SIGN),并且sDC-SIGN能够影响T细胞的增殖,活化及细胞因子的分泌。sDC-SIGN对T细胞的免疫功能的影响可能是通过sDC-SIGN与T细胞直接结合发挥作用的,而sDC-SIGN与T细胞结合的部位可能不是其CRD区。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

【参考文献】