慢病毒介导的shRNA通过干扰microRNA表达谱非特异抑制丙型肝炎病毒增殖的研究

发布时间：2018-04-05 15:12

  本文选题：短发卡RNA　切入点：小RNA　出处：《北京协和医学院》2012年硕士论文

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎及诱发的肝硬化、肝癌等疾病已严重威胁到人类健康,缺乏相应的疫苗和抗病毒药物的局限性是控制HCV感染和治疗相关疾病的主要障碍。HCV主要依赖于宿主因子完成病毒的入侵、复制、组装和释放,因此找出与HCV相互作用的宿主因子有助于阐明HCV的感染过程和宿主应答的分子机制,同时对发现新的抗病毒治疗的药物靶标和研制有效的HCV疫苗有着重要的理论和实际意义。HCV感染能诱导宿主细胞发生自噬,HCV复制的起始依赖于自噬相关蛋白,而且HCV诱导的自噬通过抑制宿主细胞天然免疫应答进而促进HCV的复制。但是HCV利用自噬进行自身复制的具体分子机制目前仍不清楚。本课题组在筛选与HCV诱导自噬相关的宿主因子时,发现荷电多囊体蛋白4B(charged multivesicular body protein 4B, CHMP4B)表达升高。CHMP4B作为转运必需内涵体分选复合物-Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅲ, ESCRT-Ⅲ)的重要组成部分,参与细胞分裂,调节自噬,同时还参与HCV病毒颗粒的释放。但是,CHMP4B调节自噬和影响HCV病毒颗粒释放的具体分子机制不明。因此,本研究拟解决的第一个问题是：CHMP4B在HCV感染中发挥的作用是什么?本研究利用慢病毒介导的shRNA敲低CHMP4B,通过Western Blot和Real-time PCR检测发现,瞬时敲低CHMP4B导致宿主细胞内HCV蛋白水平下降而HCV RNA水平不变。为进一步研究CHMP4B通过与哪些宿主蛋白相互作用从而影响HCV蛋白表达,我们拟利用串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)技术筛选HCV感染时与CHMP4B相互作用的宿主蛋白。为此,我们利用慢病毒介导的shRNA构建了CHMP4B稳定敲低的Huh7.5细胞系,拟通过外源表达与内源表达水平相当的带纯化标签的CHMP4B进行串联亲和纯化以获得与CHMP4B相互作用蛋白。然而,我们通过Western Blot和Real-time PCR发现,稳定转导CHMP4B shRNA和无靶标对照shRNA时Huh7.5细胞胞内HCV蛋白和RNA水平均明显下降,而瞬时转导无靶标对照shRNA胞内HCV蛋白和RNA水平无明显变化,提示shRNA稳定转导可能诱导产生脱靶效应抑制HCV的增殖。因此,本研究针对shRNA稳定转导诱导的这种非特异性脱靶效应的机制进行了深入研究。为了验证脱靶效应是不是由于激活天然免疫应答所致,首先,我们通过双荧光素酶报告系统检测HCV感染后shRNA稳定转导细胞中IFN-β启动子的活性,发现IFN-β启动子活性无明显变化,提示脱靶效应并非通过激活I型干扰素通路诱导产生；其次,我们通过Real-time PCR方法检测shRNA稳定转导细胞上清处理Huh7.5细胞后胞内HCVRNA的变化,发现胞内HCV RNA的含量无明显变化,提示脱靶效应也不依赖于抗病毒因子的产生。瞬时转导时shRNA高水平表达会通过干扰宿主miRNA从而抑制HCV复制,提示shRNA的稳定转导可能也干扰miRNA的表达从而抑制HCV复制,因此本研究用miRNA芯片检测了shRNA稳定转导细胞的miRNA表达谱。结果发现宿主细胞的miRNA表达谱发生显著变化,提示脱靶效应的产生可能与miRNA表达谱的变化相关。对miRNA表达谱进一步分析表明,低水平的shRNA稳定表达即可影响宿主miRNA的表达,进而影响HCV增殖。另外,shRNA整合位点也可能影响miRNA表达谱的变化,进而影响HCV的增殖。miRNA表达谱中有60个miRNA表达水平有两倍以上的变化,其中三个miRNA文献已报道参与HCV感染的调控：miR-196a、miR-491和miR-149。为进一步验证是不是miRNA表达谱的变化影响了HCV的增殖,除上述3个miRNA卜,本研究还挑选了变化倍数较大且与上述miRNA变化趋势一致的4个miRNA:miR-1246、miR-193、miR-744和miR-769,通过Real-time PCR检测转染相应miRNA mimic和inhibitor后HCV增殖的情况。结果发现,过表达miR-196a或敲低miR-491均抑制HCV的增殖,与文献报道一致,miR-149对HCV增殖无影响,也与文献报道其参与调控HCV入侵一致；过表达miR一1246抑制HCV增殖,而miR-744、miR-193和miR-769对HCV增殖无影响。上述结果提示,慢病毒介导的shRNA通过干扰miRNA表达谱非特异性抑制HCV的增殖。另外,我们新发现miR-1246参与调控HCV增殖,其具体分子机制仍待进-步研究。综上所述,我们的研究一方面提高了对慢病毒shRNA稳定转导产生非特异性脱靶效应的认识,另一方面本研究鉴定出的受shRNA调节的miRNA可能会为HCV感染提供新的治疗策略。
[Abstract]:Hepatitis C virus (Hepatitis C, Virus, HCV) infection caused by hepatitis C virus and induced liver cirrhosis, liver cancer and other diseases have been a serious threat to human health, the lack of limitation of vaccines and antiviral drugs is the main obstacle to the corresponding control of HCV infection and treatment of diseases related to.HCV mainly depends on the completion of virus invasion to host factor replication, assembly and release, the molecular mechanism of the infection process and host response of the host factor therefore find out the interaction between HCV and HCV will help to clarify, but the discovery of new drug targets of antiviral therapy and the development of effective HCV vaccine has important theoretical and practical significance of.HCV infection can induce cell autophagy initiation HCV replication is dependent on autophagy related protein and HCV induced autophagy by inhibiting host cell innate immune response and promote the replication of HCV. But HCV by self Bite of the molecular mechanism of self replication is not clear. This research group induced autophagy associated host factor in screening and HCV, found that charged multivesicular body protein 4B (charged multivesicular body protein 4B, CHMP4B) increased the expression of.CHMP4B as the essential connotation of complex transport body separation - III (endosomal sorting complex required for transport- third, ESCRT- III) an important part involved in cell division, is also involved in the regulation of autophagy, HCV virus particle release. However, CHMP4B regulates autophagy and influence the molecular mechanism of HCV virus particle release is unknown. Therefore, this study intends to solve the first problem is: what is the CHMP4B play in HCV infection? This study using lentivirus mediated shRNA knockdown of CHMP4B by Western, Blot and Real-time PCR assay showed that the transient knockdown of CHMP4B resulted in host cells in HCV eggs The white level was decreased and HCV RNA level unchanged. For the further study of CHMP4B through which host proteins interact to influence the expression of HCV protein, we proposed using tandem affinity purification (tandem affinity, purification, TAP) screening of HCV infection of host proteins interacting with CHMP4B. Therefore, we used lentivirus mediated shRNA constructs CHMP4B stable cell line on Huh7.5 low, quasi and endogenous expression of tandem affinity purification to obtain the interaction between CHMP4B and protein purification tag CHMP4B equivalent level by exogenous expression. However, I have passed Western Blot and Real-time PCR found that stable transduction of CHMP4B shRNA and no shRNA target control level of HCV protein and RNA Huh7.5 cells were significantly decreased, while the instantaneous control level of HCV protein transduction without target and RNA shRNA cells had no obvious change, suggesting that shRNA may lead to stable Miss effect induced by inhibit the proliferation of HCV. Therefore, the study of mechanism for this non-specific off target effects induced by shRNA stable transduction is studied. In order to verify the effect of distance is not due to the result of the activation of the innate immune response, first of all, we through dual luciferase reporter system for detection of HCV infection after shRNA stable cells IFN- beta promoter activity, IFN- beta promoter activity had no obvious change, that is not miss effect induced by activation of type I interferon pathway; secondly, we through the change of Real-time PCR method for detection of shRNA stably transduced cell supernatant after treatment of Huh7.5 cells with intracellular HCVRNA, found that the content of intracellular HCV RNA had no obvious change. That Miss effect does not depend on antiviral cytokines. ShRNA high level expression of instantaneous transduction through interference with the host miRNA inhibits HCV complex System, expression of stable transduction of shRNA may also interfere with miRNA to inhibit the replication of HCV, based on the miRNA chip shRNA stable transduction cell miRNA expression spectrum. The results showed that the expression changes of host cells of miRNA, suggesting that Miss effect may be related to the change of spectrum and the expression of miRNA expression further. According to the analysis of the miRNA, shRNA stable low level expression can influence the expression of host miRNA, thereby affecting the proliferation of HCV. In addition, the integration sites of shRNA may also the expression of miRNA, thereby affecting HCV proliferation.MiRNA expression profiles in 60 miRNA expression level changes by more than two times, of which three miRNA it is reported that participate in the regulation of HCV infection: miR-196a, miR-491 and miR-149. for further validation is not miRNA expression changes affect the proliferation of HCV, in addition to the above 3 miRNA, and the The study also picked up 4 miRNA:miR-1246, and the changes of multiple large miRNA changes with the miR-193, miR-744 and miR-769, by HCV Real-time PCR was used to detect the proliferation of miRNA mimic and inhibitor. The results showed that miR-196a overexpression or knockdown of miR-491 inhibited the proliferation of HCV, consistent with the literature, miR-149 the impact of the proliferation of HCV, and also reported to participate in the regulation of HCV invasion; overexpression of miR 1246 inhibit the proliferation of HCV, miR-744, miR-193 and miR-769 had no effect on the proliferation of HCV. The results indicate that the lentivirus mediated shRNA spectrum of nonspecific inhibition of HCV proliferation by interfering miRNA expression. In addition, our new miR-1246 is involved in the regulation of HCV proliferation and its molecular mechanism remains to be further studied. To sum up, on the one hand, we improve the non specificity of shRNA lentiviral transduction stable target The understanding of the effect, on the other hand, the shRNA - regulated miRNA in this study may provide a new therapeutic strategy for HCV infection.

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R373.21

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本文编号：1715307