登革病毒EDⅢ蛋白的表达、纯化及其与ECV304细胞相互作用蛋白的筛选与鉴定研究

发布时间：2018-04-08 23:38

  本文选题：登革病毒　切入点：包膜E蛋白　出处：《第三军医大学》2012年博士论文

【摘要】：登革病毒(dengue virus, DENV)是黄病毒属(Flaviviridae)有包膜的单股正链RNA病毒，有四个血清型(DENV-1~4)，以蚊虫为媒介，广泛流行于热带和亚热带地区。DENV感染所致的人类登革热(classical dengue fever, DF)和登革出血热/登革休克综合征(denguehemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)严重危害人类健康。全球有25～30亿人生活在流行区内，每年有1亿以上的人遭受感染，DHF病例约50万,死亡率5～20％，如治疗不及时可达50％。近年来，随着全球气候变暖、人口流动、生态环境恶化、蚊媒分布区域扩展等诸多原因，登革热流行的范围和频率不断增加，WHO已将DHF/DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区也都是重点流行区域，多次发生DF，DHF/DSS的爆发流行。但时至今日，对DENV感染性疾病尚无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世。因此，对DENV的致病机理展开深入研究，并从中发掘有效的治疗策略和途径是当前病毒学研究的当务之急。 DENV经蚊虫叮咬进入人体后，先在单核细胞系统(如树突状细胞，单核细胞等)和毛细血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)等靶细胞中增殖，经血流播散，引起疾病。血中高滴度的病毒可累及全身毛细血管内皮细胞，引起广泛微血管内皮功能障碍，血管通透性增加、出血和休克，介导DHF/DSS的发生。所以，人血管内皮细胞膜上必然存在着介导DENV感染的受体，但该受体迄今尚未阐明。因此，鉴定出血管内皮细胞膜上的DENV受体，对研究DENV的致病机理、研发受体特异性阻断剂等均具有非常重要的意义。 DENV受体的研究很早就受到重视，研究的方法也有很多，其中病毒铺覆蛋白印迹技术(Virus overlay protein binding assay,VOPBA)是较为“经典”的一种病毒受体筛选技术，该方法是以Western blot为基础，将细胞膜蛋白转印至PVDF膜上与病毒颗粒进行孵育，利用病毒颗粒与受体蛋白特异性结合的特点，分离病毒受体。VOPBA方法在鉴别病毒受体中虽应用广泛，但也有一定的局限性，如由于与转印膜孵育的是完整病毒颗粒，个头相对较大，与转印膜上的潜在受体蛋白结合不稳定，易造成漏筛，所以如果利用DENV与受体结合的关键结构域——包膜E蛋白DⅢ区代替完整病毒颗粒进行VOPBA将更有助于病毒受体的筛选。 本研究首先采用原核表达并纯化了DENV-2E蛋白DⅢ区(EDⅢ)蛋白，用于代替全病毒颗粒建立改良的VOPBA技术，并以人血管内皮细胞来源的ECV304细胞系为靶细胞进行DENV相互作用蛋白的筛选工作，对筛选到的候选蛋白进行质谱分析、Westernblot实验等进一步验证筛选蛋白，再通过免疫共沉淀(Co-IP)实验和激光共聚焦显微技术明确筛选蛋白与DENV-2EDⅢ蛋白的相互关系及与病毒的共定位情况；最后，用生物信息学的方法模拟筛选蛋白与DENV-2EDⅢ蛋白可能的结合方式和参与结合的残基，探讨筛选蛋白在DENV-2感染宿主细胞过程中的作用，为进一步揭示DENV的感染机制、研发受体特异性阻断剂奠定坚实的基础。 其研究内容和结果主要包括以下几个方面： 1. DENV-2EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备：①利用PCR从pV-DENV2-E质粒上扩增出EDⅢ基因；②通过酶切连接将EDⅢ基因亚克隆至原核表达载体pET22b+中，转化入大肠杆菌Rosetta(DE3) plysS；③对pET22b-ED Ⅲ/Rosetta工程菌进行表达，并对表达条件进行摸索，获得的工程菌表达产物经超声裂解后，EDⅢ蛋白质以包涵体的形式存在；④pET22b-ED Ⅲ/Rosetta工程菌表达得到的目的蛋白包涵体，经Ni-NTA亲和层析和阳离子交换层析两步纯化后，获得纯度达98％以上的目标蛋白，并对蛋白进行Western blot鉴定；⑤将纯化好的目的蛋白经透析法复性，并采用改良Lowry法进行蛋白质定量后，冻存备用；⑥为获得目的蛋白抗体，将目的蛋白分别免疫Balb/c和C57BL/6小鼠，得到相应抗体后加等体积甘油冻存备用。 2.改良VOPBA方法筛选ECV304细胞上DENV相互作用蛋白：①利用差速离心的方法提取人血管内皮ECV304细胞各组分蛋白；②用纯化的DENV-2EDⅢ蛋白代替全病毒颗粒，建立了改良的VOPBA技术，并成功在ECV304细胞膜蛋白提取物中筛选到34,43和55kDa三个蛋白能与EDⅢ蛋白相互作用，质谱分析显示筛选到的43kDa蛋白为微丝(fibrous-actin，F-actin)，55kDa蛋白为波形蛋白(vimentin)；③制备43kDa蛋白小鼠抗血清进行阻断改良VOPBA实验和Western blot实验，进一步证实选到的43kDa蛋白为actin；④利用Co-IP实验体外验证actin与DENV-2EDⅢ蛋白相互作用，提示DENV可能是通过包膜E蛋白Ⅲ区这样功能结构域结合actin的。 3.43kDa actin蛋白在DENV感染过程中的作用：①激光共聚焦显微技术观察DENV-2感染不同时相点的人血管内皮ECV304细胞中微丝骨架的形态变化，感染第5min时，细胞微丝出现了解聚，较多的短F-actin积聚形成团块，从感染的第35mim～1h，部分应力纤维束开始恢复，主要分布在细胞膜下的皮质区，感染24h后，由于病毒的大量复制、病毒蛋白的堆积，又能再次引起F-actin的解聚以及应力纤维的消失，这提示我们DENV是通过改变actin来进入细胞的；②利用免疫荧光双染色进一步观察感染24,48和96h的ECV304细胞actin与DENV-2E蛋白的细胞定位情况，发现actin与E蛋白有明显的随感染时间逐渐增强的共存，提示除了进入之外，actin可能参与了DENV-2颗粒在细胞内的运输等其它感染过程。 4. F-actin结合DENV-2EDⅢ的方式及结合残基的预测：①从PDB蛋白晶体结构数据库下载天然结构的F-actin和可溶性的DENV-2EDⅢ蛋白结构，采用ZDOCK软件将结构数据传输到浪潮天梭高性能服务器集群完成对actin和EDⅢ蛋白的分子对接，根据得分情况获得5个最佳结合的复合物结构；②采用KFC2软件对这5个复合物进行了结合残基的预测，分析了F-actin和EDⅢ蛋白结构中最可能发生相互结合的残基位点。 综上所述，本研究用纯化的DENV-2EDⅢ蛋白代替全病毒颗粒，建立了改良VOPBA技术筛选人血管内皮细胞登革病毒相互作用蛋白，却意外发现作为细胞骨架的actin在DENV-2的整个感染过程中都起了非常重要的作用，参与病毒的进入、胞内运输及释放等过程。由于actin与EDⅢ蛋白在体外能发生相互作用，，并与E蛋白在体内有随感染时间逐渐增强的共存，提示EDⅢ蛋白可能是病毒与actin相互作用的重要组分，并且我们利用生物信息学软件对actin与DENV-2EDⅢ蛋白可能的结合方式和结合残基进行了预测。这一实验结果为后续设计蛋白突变体深入研究两者相互关系，揭示DENV的感染机制提供了重要的实验依据。当然，DENV与actin相互作用的机制以及其中所涉及的信号调控通路还有待于深入研究。
[Abstract]:The dengue virus ( DENV ) is a single strand RNA virus enveloped by Flaviviridae . There are four serotypes ( DENV - 1 - 4 ) , which are widely popular in tropical and subtropical regions .

DENV , which has been bitten into human body by mosquito bite , is propagated through the target cells such as monocyte system ( such as dendritic cells , monocytes , etc . ) and vascular endothelial cells ( vascular endothelial cells ) . The virus of high titer in blood can be involved in the development of vascular endothelial cells . Therefore , it has not been clarified so far . Therefore , it is very important to study the mechanism of DENV on vascular endothelial cell membrane , develop receptor - specific blocking agent and so on .

Virus overlay protein binding assay ( VOba ) is a kind of virus receptor screening technique , which is based on Western blot .

In this study , we used prokaryotic expression and purified DENV - 2E protein D鈪

本文编号：1723894