肝再生中的基因表达调控机制研究

发布时间：2018-04-09 03:19

本文选题：肝再生　切入点：基因表达调控　出处：《第二军医大学》2012年博士论文

【摘要】：肝脏是一种具有极强再生能力的器官之一。虽然肝细胞属于终末分化细胞，一般情况下都处于静止状态，很少增殖。但是在出现肝脏损伤的情况，如肝脏部分切除、化学性或病毒性肝损伤、肝脏肿瘤等原因造成肝脏细胞损伤、坏死和肝细胞功能超载，都可以立即诱发和启动肝细胞增殖和肝脏再生过程。肝再生过程大致可以分为三个阶段：早期阶段（启动期），中期阶段（增殖期）和晚期阶段（终止期）。以往的研究热点多关注于单个信号分子，，重要转录因子以及相关靶基因和信号通路的研究；此外，也有部分基于蛋白质组、mRNA表达谱的组学研究。但这些常规研究方法对肝再生基因表达调控机制的阐明有限，不能全面解析肝再生过程中差异基因表达调控的分子机制。因此，本课题主要从微小RNA（microRNA）和转录因子这两个具有不同调控主体的层面，对肝再生过程中基因表达调控的分子机制进行探讨。第一部分肝再生中microRNA表达谱筛选及差异microRNA的功能研究近年来关于非编码小RNA（non-coding small RNA）的研究进展使我们对于肿瘤等多种与增殖、分化相关的疾病有了新的认识。microRNA（miRNA）是一组生物体基因组编码的内源的非编码小RNA。这一类RNA分子可以在转录后水平对其靶基因进行调控（如降解mRNA或抑制mRNA翻译），由于被调控靶基因涉及生命过程各个方面，所以microRNA在细胞增殖、生长、分化、肿瘤发生等过程中起着非常重要的调控作用。新近研究提示，microRNA还可能参与了肝癌和肝再生过程。为探讨miRNA在肝再生过程中的变化规律及生物学功能，本课题运用microRNA微阵列和实时定量PCR技术在大鼠和小鼠的肝再生模型中初步筛选和验证了显著差异表达microRNA。我们的研究显示：在肝再生早期miR-376b，miR-494及miR-127，均显著下调；在肝再生晚期miR-34a以约5倍的差异上调最为显著。随后，我们分别在大鼠或小鼠肝再生模型中对miR-34a，miR-376b和miR-494进行后续靶基因和功能研究。 miR-34a功能研究：通过体外实验，我们证实miR-34a能显著抑制肝细胞增殖，并且影响肝细胞周期。随后，我们在细胞学水平通过qRT-PCR，westernblot和荧光素酶报告基因实验验证Met和inhibin βB (INHBB)，证实它们受miR-34a调控。INHBB-si-RNA干扰实验提示INHBB可能是一个细胞增殖促进因子。因此，我们推测在肝再生晚期，它可能受miR-34a调控而下调，从而有助于肝细胞增殖终止。同时，我们检测到在肝再生晚期INHBB和Met显著下调，提示它们在体内也受miR-34a调控。最后，通过染色质免疫共沉淀（ChIP）-PCR实验，我们发现肝再生晚期miR-34a的上调与P53密切相关。 miR-376b和miR-494的功能研究：miR-376b和miR-494都位于小鼠12号染色体的DLK1-GTL2印记区域内，提示肝再生早期DLK1-GTL2印记域内的miRNA簇有共同的调控机制和变化趋势。通过体外增殖实验，我们证实miR-376b和miR-494均能显著抑制肝细胞增殖。随后，我们联合运用miRNA预测靶基因（生物信息学预测）-差异表达蛋白质（定量蛋白质组学）相结合的方法寻找潜在靶基因。最后通过miRNA模拟物和qRT-PCR的方法，我们推测miR-376b和miR-494可能分别通过相应靶基因影响肝细胞增殖或凋亡。第二部分小鼠肝再生早期转录因子活性谱及转录调控网络研究由于目前国际上尚未见在肝再生研究领域对转录因子活性谱进行高通量筛选的报道。因此，本课题首次在肝再生模型中运用转录因子活性谱芯片（同时检测约200个转录因子活性）对小鼠肝再生早期变化的转录因子进行高通量筛选，得到了16个活性上调的转录因子，1个活性显著下调的转录因子，其中包括上游激活转录因子1（upstream stimulatory transcription factor1，USF1）在内的多个转录因子尚未见在肝再生中的报道。因此，本课题以筛选的转录因子USF1为研究重点，通过染色质免疫共沉淀结合芯片（ChIP-on-chip），肝再生早期全基因组表达谱以及生物信息学等研究手段，构建小鼠肝再生早期以USF1为核心的转录调控网络；最后我们通过ChIP实验验证了早期肝再生组织中USF-1与多个转录因子协同调控靶基因的现象。基于上述分析，本课题利用经典的大鼠或小鼠70%肝切除术后的肝再生模型，研究肝再生过程中的microRNA表达谱和差异microRNA，转录因子活性谱和差异转录因子，并探讨相关分子机制。本研究将有利于丰富对肝再生过程中基因表达调控机制的研究，为肝癌、肝硬化、病毒性肝炎等肝脏疾病的治疗提供分子机理的理论和实验依据。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【共引文献】