乙酰肝素酶的原核表达及其单克隆抗体的制备

发布时间：2018-04-12 13:57

  本文选题：乙酰肝素酶 + 原核表达　； 参考：《广东药学院》2012年硕士论文

【摘要】：目的：虽然已经明确了HPSE在肿瘤转移中的相关作用，但还有很多方面有待研究，为了研究HPSE在肿瘤发生、肿瘤浸润、转移及血管生成中所起的作用，获得大量的HPSE以及其抗体，就显得很有必要。本研究利用原核表达系统获得相关HPSE抗原，成功得到以包涵体形式表达的人全长HPSE蛋白，并运用杂交瘤技术获得抗HPSE的单克隆抗体。 方法：依据NCBI上公布的人HPSE cDNA序列，设计可以克隆HPSE全长片段的引物，选择NcoⅠ和XhoⅠ作为酶切位点，将HPSE全长基因片段连接到pET28a(+)质粒上，在大肠杆菌中表达HPSE蛋白；探索不同诱导时间、不同浓度的诱导剂IPTG以及所用的培养基对重组人HPSE蛋白表达的影响；运用HisTrap TMcrude柱得到纯度较高的重组人HPSE蛋白。 本室自制的重组人HPSE50kDa蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术将SP2/0与免疫B淋巴细胞融合，间接ELISA检测抗体分泌情况，ELISA所用的抗原为重组人HPSE全长蛋白、重组人HPSE50kDa蛋白以及人HPSE多肽Lys158-Cys172，该多肽包含底物肝素与HPSE结合的特定序列，即HPSE的活性位点。阳性克隆进行多次筛选以及亚克隆，得到抗HPSE的单克隆抗体。Western blot检测所制备的抗原与抗体结合的特异性。 结果：成功在大肠杆菌中表达出重组人HPSE全长蛋白，并得到其最佳表达条件为：IPTG浓度为1mmol/L，诱导时间为5h，在2×YT培养基中诱导时目的蛋白表达量最高。成功的筛选出两株特异性较好抗HPSE的单克隆抗体，4D12、3F5效价均大于1:1.28×105，其亲和力常数分别为2.71×109M-1、6.67×108M-1，4D12与50kDa HPSE、人全长HPSE反应，3F5与50kDa HPSE、人全长HPSE以及HPSE50kDa N端的Lys158-Cys172多肽反应。 结论：成功构建了人HPSE原核表达系统，，并筛选出两株特异性好抗HPSE的单克隆抗体。
[Abstract]:Objective: although the role of HPSE in tumor metastasis has been clarified, there are still many aspects to be studied. In order to study the role of HPSE in tumorigenesis, tumor invasion, metastasis and angiogenesis, a large number of HPSE and its antibodies were obtained.It is necessary.In this study, HPSE antigens were obtained by using prokaryotic expression system, and human full-length HPSE proteins expressed in inclusion bodies were successfully obtained, and monoclonal antibodies against HPSE were obtained by hybridoma technique.Methods: according to the human HPSE cDNA sequence published on NCBI, primers were designed to clone the full-length HPSE fragment. Nco 鈪

本文编号：1740031