肠源性内毒素血症在NAFLD、T2DM发病中的作用及其分子机制的研究

发布时间：2018-04-15 04:21

  本文选题：肠源性内毒素血症 + 代谢综合征　； 参考：《山西医科大学》2012年博士论文

【摘要】：近些年来随着饮食生活方式的改变,以脂肪、糖类(蔗糖或果糖)为代表的高热量食物和饮料所占比例明显增加,超重与肥胖者日益增多,脂肪肝、Ⅱ型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)、高血压及心脑血管疾病等代谢性疾病的发病率呈逐年增高的趋势,而非洒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)作为代谢综合征(metabolic syndrome, MS)在肝脏的表现也愈加受到重视。现已证实NAFLD大多伴有肠源性内毒素血症(Intestinal endotoxemia, IETM)。我们实验证实皮下小剂量注射LPS第9周可使大鼠发生胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH),结合Cani应用高脂膳食可引起代谢性内毒素血症,并可诱发肥胖与胰岛素抵抗,使我们联想IETM是否既可引起慢性低度炎症又可引发以IR为基础的代谢综合征,在NAFLD、T2DM等代谢综合征相关疾病的发生发展中可能发挥着启动作用,因此设计以下实验来证实我们的观点。 本论文共分三部分： 第一部分代谢综合征及其相关疾病动物模型的建立 第二部分IETM在MS及相关疾病发生发展中的作用的研究 第三部分IETM启动MS相关代谢疾病的基本机制 第一部分通过长期高糖高脂饮食建立代谢综合征及其相关疾病的动物模型 实验一大鼠体重及内脏脂肪重量的改变 选取64只雄性SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为8组：3月正常对照组8只(3C),6月正常对照组8只(6C),9月正常对照组8只(9C),12月正常对照组8只(12C),以正常饮食喂养；3月高糖高脂组(3H)8只,6月高糖高脂组(6H)8只,9月高糖高脂组(9H)8只,12月高糖高脂组(12H)8只,采用高糖高脂膳食(70%正常饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇十0.25%胆酸)喂养。上述各组动物均在天黑前投食,自由饮水,每月称体重一次。分别于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末于大鼠麻醉状态下,称取体重；量取体长,计算Lee's指数；并于无菌条件下摘取肝脏、内脏脂肪组织(附睾和肾周)称重,计算肝脏、内脏脂肪与杀鼠前大鼠重量比值。结果：经高糖高脂膳食喂养后,各阶段模型组大鼠与正常组大鼠相比,体重、Lee's index明显增加(p0.05)；肝指数、内脏脂肪占体重百分比明显增加(p0.05)。提示经过高糖高脂饮食喂养可诱发大鼠发生超重和肥胖。 实验二大鼠血浆炎症介质的变化 上述动物于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液LPS、TNFa、CRP的改变。结果：经高糖高脂喂养一年的大鼠各阶段血浆LPS、TNFa、CRP水平明显高于正常对照组(P0.05),提示经高糖高脂喂养大鼠在第3个月时已形成肠源性内毒素血症和低度炎症,且持续增高至第12个月。 实验三大鼠血脂及肝酶的改变 上述动物于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液TG、Tch、HDL-c、 LDL-c和ALT的改变。结果：经一年高糖高脂喂养模型组大鼠于实验第三月末已出现高甘油三酯血症、高胆固醇血症、异常脂蛋白血症；肝酶ALT活性明显升高。 实验四FPG、FIN、HOMA-IR、HOMA-β及大鼠糖耐量的改变 上述动物于实验第2月末进行腹腔糖耐量,并于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液FPG、FINS、HOMA-IR和HOMA-β的改变。结果：大鼠糖耐量明显降低；FPG、FINS和HOMA-IR的水平都升高,其差异有统计学意义；而HOMA-p以第六个月出现代偿性增强后进行性衰退。糖耐量实验的五次采血均显示高糖高脂组的血糖水平明显高于正常对照组,表明大鼠糖耐量明显降低。 实验五肝脏、胰腺及脂肪组织的病理改变及肝细胞、胰岛β细胞凋亡的观察 上述动物分别于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末于大鼠麻醉状态下,摘取肝脏、胰腺和内脏脂肪组织固定于10%中性福尔马林溶液,石蜡包埋切片,进行HE染色,光镜下观察病理学改变。运用TUNEL进行肝细胞、胰岛β细胞凋亡的观察。结果：病理组织学显示肝脏发生严重的脂变、脂肪肝进而发生肝炎、纤维化及肝硬化；随时间进展胰岛逐渐萎缩并伴有炎性浸润；脂肪细胞逐渐增大并伴有炎性浸润。TUNEL结果显示高糖高脂组3-12月见到肝细胞、胰岛凋亡细胞数量逐渐增加,与正常对照组相比有显著性差异。 综合第一部分的实验结果归纳如下：①高糖高脂喂养一年大鼠出现了肥胖和内脏脂肪的增加,异常脂蛋白血症,糖耐量减低和空腹血糖升高等代谢综合征的主要组份；②高糖高脂喂养一年大鼠肝脏发生严重的脂变、脂肪肝进而发生肝炎、纤维化及肝硬化,符合NAFLD的整个过程；③高糖高脂喂养一年早期大鼠出现IR,后期病理观察胰岛萎缩,TUNEL证实胰岛细胞数量逐渐减少导致分泌功能进行性下降最终衰竭走向显性T2DM。④非酒精性脂肪性肝病与II型糖尿病都属于MS相关的疾病,这一组疾病其本质是慢性低度炎症性疾病,其共同的基本发病机制是胰岛素抵抗,高糖高脂喂养一年大鼠出现慢性低度炎症,并且胰岛素抵抗指数明显增加并且始终保持高水平。⑤虽然整个实验时间过长,但符合临床实际,可通过渐进过程深入了解其病理过程,是研究代谢综合征及其相关疾病的成功的动物模型。 第二部分IETM在MS及相关疾病(NAFLD与T2DM)发生发展中的作用的研究 实验六IETM诱发慢性低度炎症 上述动物于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液MCP-1的水平,免疫组化方法检测内脏脂肪组织、肝组织、胰腺组织中CD68的表达情况。结果：经高糖高脂喂养一年的大鼠各阶段血浆MCP-1水平明显高于正常对照组(P0.05),且持续增高至第12个月。免疫组化结果显示各阶段高糖高脂组大鼠的脂肪组织、肝组织、胰腺组织CD68表达水平明显升高,且随时间推移加重。 实验七IETM与胰岛素抵抗 检测各阶段大鼠肝脏TG含量,并对肝脏TG与IR, LPS与IR进行相关性分析。结果：各阶段肝TG含量明显升高,并且肝TG与IR, LPS与IR呈显著正相关。 实验八脂质异地沉积 检测各阶段大鼠血浆FFA的含量,并对肝脏、胰腺进行苏丹IV染色观察脂肪沉积情况。结果：经一年高糖高脂喂养模型组大鼠于实验第三月末FFA水平已明显升高,至第六个月达到高峰并持续升高至第十二个月,肝脏、胰腺组织可见程度不等的脂肪沉积。 综合第二部分的实验结果,归纳如下：①高糖高脂诱导的非酒精性脂肪性肝病存在肠源性内毒素血症,并且一直延续至T2DM的出现。②ETM可以诱发慢性低度炎症反应。③ETM通过脂解作用促进肝、胰的异位脂质沉积,影响并决定着IR的发生。 第三部分IETM启动MS相关代谢疾病的基本机制 实验九氧化应激 检测各阶段大鼠血浆SOD、MDA的水平,并观察肝脏、胰腺ROS的改变。结果：大鼠血浆SOD水平显著降低,而MDA水平显著升高,且LPS与SOD呈负相关,LPS与MDA呈正相关；肝脏的ROS含量于实验第三个月开始升高,而胰腺的ROS含量于实验第六个月开始升高,并且持续升高至实验第十二个月,这些结果提示氧化应激的存在。 实验十内质网应激 采用Western blotting测定用组织、胰腺组织中JNK1、p-JNK1、NFκBp65、IκB、GRP78蛋白表达水平。结果：各阶段高糖高脂组的大鼠肝组织p-JNK1、NF-κBp65、GRP78表达显著高于正常组,而I-KB表达显著低于正常组；高糖高脂组的大鼠胰腺组织p-JNKl、 NF-κBP65的表达于第六个月开始升高,第九个月、第十二个月达到高峰,而I-κB的表达也于第六个月开始降低。模型组GRP78的表达自第三个月开始增强,于第九个月升至最高且持续至第十二个月保持较高水平,与对照组差异明显。这些结果提示肝脏、胰腺均发生了内质网应激。 综合第三部分的实验结果,归纳如下：①模型组大鼠血浆中MDA水平增加而抗氧化酶SOD的水平减少,并且MDA的改变与LPS呈显著正相关,SOD的改变与LPS呈显著负相关；同时肝脏和胰腺的ROS水平有不同程度的增加,进一步支持LPS可通过诱发氧化应激参与NAFLD、T2DM等MS相关疾病的发生发展。②血中LPS升高水平与肝脏、胰岛P-JNK、NF-κB和GRP78走向大体一致,LPS可能通过肝脏和胰岛浸润的单核巨噬细胞,诱发内质网应激,使GRP78从跨膜蛋白脱落入血,使p-JNK和NF-κB信号蛋白表达增加。 综上所述,本研究得出以下结论： 1.高糖高脂膳食喂养大鼠可以成功复制和人类临床实际更为接近的代谢综合征及其相关疾病的模型。 2.高糖高脂所致的非酒精性脂肪性肝病伴有肠源性内毒素血症,并且一直延续达一年之久。 3.IETM可以诱发慢性低度炎症与胰岛素抵抗,并可以通过脂解作用引起脂质异地沉积,使肝细胞蓄积大量TG、炎症并伴有纤维化；使胰岛p细胞发生IR、炎症、胰岛素分泌减少和胰岛β细胞凋亡发生。 4.LPS所致的氧化应激与内质网应激可能是启动NAFLD与T2DM发生的基本机制。
[Abstract]:In recent years , with the change of dietary lifestyle , the proportion of high calorie foods and beverages represented by fat , sugar ( sucrose or fructose ) increased significantly , and the incidence of metabolic diseases such as fatty liver , type 鈪，

本文编号：1752502