人可溶性BTLA酶联检测试剂盒的研制及其应用的研究

发布时间：2018-04-16 08:30

本文选题：BTLA + HVEM　；参考：《苏州大学》2012年硕士论文

【摘要】：共信号分子在免疫细胞上的调节性表达、相互作用及介导的信号参与了免疫应答的有效启动、持续和适时终止。根据共信号分子的结构的不同，可以将其分成两大超家族：免疫球蛋白（B7/CD28或Ig）超家族和肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体（TNF/TNFR）超家族；此外，基于在免疫反应中功能效应的不同，共信号分子又可分为共刺激分子和共抑制分子。T细胞的完全活化需要共信号分子的参与，否则将导致T细胞无能。BTLA（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）是新近发现的B7/CD28家族成员，与CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen4）和程序性死亡受体-1（programmed cell death1，PD-1）相似，是又一表达在活化的T细胞表面的共抑制受体分子，其配体HVEM（herpesvirus entry mediator）则主要表达在免疫细胞、非淋巴组织和某些肿瘤细胞。BTLA与HVEM间相互作用介导的负性信号可以阻滞细胞周期，抑制CD4~+T和CD8~+T细胞的增殖及IL-2等细胞因子的分泌，在参与维持外周耐受、防止机体自身免疫应答等方面具有重要的生物学意义。然而，近期研究表明BTLA和HVEM之间有trans和cis两种作用方式，信号传递也具有双向性的特点，其中trans作用是BTLA作为配体向相邻细胞上的HVEM传递正性信号，直接活化HVEM依赖性的NF-κB的转录；而同一细胞上的BTLA和HVEM之间的cis作用阻断了trans作用对HVEM的活化，从而使T细胞维持在初始状态。许多共信号分子能分别以细胞膜型和可溶型两种形式存在，包括OX40L、CD40L、B7-H3和PD-1等。可溶性分子可以通过蛋白水解酶裂解细胞上的膜型分子而形成，也可以由免疫细胞直接分泌。许多可溶性共信号分子具有重要的临床诊断价值，比如CTLA-4在强直性脊柱炎、PD-1在RA等自身免疫病患者体内异常存在可溶性的表达形式。天然型的可溶性BTLA（sBTLA）分子在机体内是否存在，具有何种生物学功能，在疾病的发生发展中发挥何种生物学作用，目前尚未报道。本研究构建了用于表达人BTLA-Fc融合蛋白的真核表达载体，在CHO细胞中实现了稳定表达和分泌，进一步培养和纯化获得BTLA-Fc融合蛋白，同时将BTLA-Fc作为sBTLA替代形式研究了其在体外对T细胞的生物学作用；在此基础上，联合BTLA单克隆抗体建立了特异性检测人sBTLA的酶联检测试剂盒，，并对该ELISA检测体系进行了分析、评价；利用sBTLA的酶联检测试剂盒对健康人和RA患者外周血中的sBTLA表达水平进行了初步分析。一、人BTLA-Fc融合蛋白的制备及其生物学活性的研究【目的】建立CHO/BTLA-Fc基因转染细胞株，使之能稳定分泌BTLA-Fc融合蛋白。并就BTLA-Fc融合蛋白对T细胞的体外生物学作用进行了初步研究。【方法】PCR法从本单位构建好的pEGZ-Term/B7-H1-Fc重组质粒中扩增人IgG1(Fc)恒定区，XhoI、BamHI双酶切后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接为重组质粒pIRES2-EGFP/Fc，同时PCR法从本单位构建好的pEGZ-Term/BTLA重组质粒中获得人BTLA胞外段基因片段，用NheI、XhoI双酶切插入上述pIRES2-EGFP/Fc，构建成重组表达载体pIRES2-EGFP/BTLA-Fc。脂质体法以重组载体pIRES2-EGFP/BTLA-Fc转染鼠CHO细胞，G418长期筛选并亚克隆化。通过流式细胞术分析BTLA-Fc融合蛋白的表达，Protein G亲和层析柱对上清中的融合蛋白进行纯化，Western-blot定性分析。CCK-8检测BTLA-Fc融合蛋白对抗人CD3单抗激发的T淋巴细胞增殖的影响。【结果】基因转染的CHO细胞培养上清中表达的BTLA-Fc融合蛋白能与表达BTLA配体HVEM的基因转染细胞株L929/HVEM有效结合，纯化的融合蛋白经Western-blot鉴定有清晰预期目的条带。BTLA-Fc融合蛋白对T细胞的体外增殖具有抑制作用。【结论】建立稳定分泌人BTLA-Fc融合蛋白的CHO/BTLA-Fc基因转染细胞株，表达并分离纯化获得BTLA-Fc融合蛋白，为进一步研制可溶性BTLA酶联检测试剂盒奠定了抗原基础；该BTLA-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖具有抑制作用。二、特异性检测人可溶性BTLA酶联检测试剂盒的研制【目的】研制特异性检测人可溶性BTLA（Soluble BTLA，sBTLA）的ELISA试剂盒，为定量分析不同来源的临床标本和研究sBTLA的功能提供有效的检测手段，利用该ELISA试剂盒检测不同年龄段健康人和RA患者外周血sBTLA的表达，为进一步分析sBTLA在RA发生发展过程中的作用机制奠定了基础。【方法】在本单位已成功获得的4株抗人BTLAmAb（1F11，3B6，7D7，8H9）以及一株商品化的抗人BTLAmAb（330104）的基础上，用生物素标记的1F11-bio、3B6-bio、7D7-bio和8H9-bio作为检测抗体，再与Streptavidin-HRP结合，最后用TMB作为底物进行显色反应，交叉配对获取线性关系最好的一对抗体，优化条件后建立特异性检测人sBTLA的ELISA方法。并对该试剂盒的灵敏度和特异性进行分析。利用上述建立的ELISA试剂盒检测了78例健康人和60例RA患者外周血中sBTLA的表达，另外检测了148例不同年龄段健康人外周血中sBTLA的表达。【结果】8H9/7D7-bio组合有良好的线性关系，优化条件后成功研制出检测人sBTLA的ELISA试剂盒，其能特异性应用于检测人sBTLA蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。试剂盒检测的标准曲线在抗原浓度为0.31~20ng/ml范围内有良好的线性关系，并具有良好的准确性和特异性。利用该检测试剂盒对RA患者及不同年龄段健康人外周血中sBTLA的表达水平进行定量分析显示，RA患者血清中sBTLA的含量较健康人显著增高，健康人血清中sBTLA的含量随着年龄段的增加也显著增高。【结论】研制成功特异性检测人sBTLA的试剂盒，为定量分析sBTLA蛋白因子提供了有效的检测手段。与健康对照组相比，RA患者外周血sBTLA的表达水平明显增高，健康人随着年龄段的增加其血清中sBTLA的含量也显著增高。综上所述，本课题成功构建了用于表达人BTLA-Fc融合蛋白的真核表达载体，在CHO细胞中实现了稳定表达分泌，纯化获得BTLA-Fc融合蛋白；在此基础上，建立了特异性检测人sBTLA的ELISA方法，并对该ELISA检测体系进行了分析、评价；利用sBTLA的ELISA方法对不同年龄段健康人和RA患者外周血中的sBTLA表达水平进行了分析。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】