急性高原缺氧损伤模型的建立及脑线粒体差异蛋白表达研究

发布时间：2018-04-16 11:35

本文选题：低压缺氧 + 大鼠　；参考：《河北医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的:通过建立低压缺氧模型,模拟急性高原缺氧损伤,观察不同缺氧时间点脑、肺组织损伤情况,并采用2-DE和MALDI-TOF-MS技术研究急性高原缺氧损伤脑线粒体蛋白的差异表达,以寻找其可能的分子标志物及药物治疗靶点。方法:选清洁级雌性SD大鼠60只,体重230±20g,以完全随机分组方法分为正常对照组(Control)、低压缺氧6h组、12h组、24h组。建立大鼠急性低压缺氧损伤模型,控制舱内温度、湿度、气流量及氧含量,模拟海拔7000m高度(舱内压力降至真空度0.06MPa)。急性高原缺氧损伤模型的建立:通过H.E染色和甲苯胺兰染色观察脑、肺组织形态学改变;干湿比重法检测脑、肺含水量,应用Western Blot技术检测脑、肺组织水通道蛋白(AQP)1、水通道蛋白4表达情况;生化手段检测血清乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量。急性高原缺氧损伤后脑线粒体差异蛋白的表达研究:分离纯化大脑皮质线粒体,提取各组线粒体蛋白,经双向电泳和银染得到双向电泳图谱,用PDQuest 7.0软件进行图像分析寻找差异蛋白点;进行考染,取蛋白点进行酶解,再用MALDL-TOF质谱进行分析,使用Mascot软件在NCBInr数据库中进行搜索,初步确定差异蛋白质的种类及其在损伤过程中的作用;通过Western blot进一步验证检测的蛋白。结果:1低压缺氧损伤后脑组织形态学改变:脑冠状切片H.E染色可见各低压缺氧组出现不同程度细胞损伤,神经细胞胞体缩小,核固缩、溶解,胞浆深染;随低压缺氧时间的延长,损伤逐渐加重。 2脑、肺含水量检测结果:与对照组相比,各低压缺氧组脑、肺含水量显著升高(P0.01),且随低压缺氧时间的延长而逐渐增加。 3脑、肺组织AQP1、AQP4检测结果:各低压缺氧组脑组织AQP1、AQP4表达量较对照组相比明显增高,且随低压缺氧时间的延长而逐渐增高。肺组织AQP1、AQP4表达量在低压缺氧组较对照组增高,其中AQP4的表达量随低压缺氧时间的延长而逐渐增高,而AQP1随低压缺氧时间的延长变化不明显。 4生化指标检测结果:各低压缺氧组血清LDH活性与对照组相比显著增高(P0.01),且随低压缺氧时间的延长而逐渐增高;各低压缺氧组血清SOD活性与对照组相比显著降低(P0.01),且随低压缺氧时间的延长而逐渐降低;血清CAT活性在低压缺氧6h、12h组较对照组明显降低(P0.01),低压缺氧24h组有所升高,但仍低于对照组;各低压缺氧组MDA含量较对照组明显增加。 5线粒体分离纯化结果检验透射电镜观察显示:提取的沉淀中主要成分是线粒体。纯化的线粒体为圆形或椭圆形,绝大多数线粒体有完整的膜性结构。线粒体纯度超过95%。 6大鼠低压缺氧损伤前后脑皮质线粒体蛋白双向电泳图谱分析本实验选用17cm、pH3-10范围的线性IPG胶条,对各组蛋白进行分离、分析。在2-DE胶图上可以看到蛋白点多分布于PI 4.5-10、MW 15kDa-105kDa的范围。经PDquest软件分析检测发现,与正常对照组相比(P0.05),低压缺氧6h组表达升高的有12个点,降低的有4个点;低压缺氧12h组表达升高的有16个点,降低的有5个点;低压缺氧24h组表达升高的有30个点,降低的有6个点。其中有25个点在低压缺氧各时间点表达变化相一致;有1个点在低压缺氧24h组新表达。选取在两个及两个以上低压缺氧时间点具有共同表达变化趋势或是变化趋势具有时间依赖性的点作为差异蛋白点进行后续分析。 7差异蛋白质的质谱鉴定对所取得的差异蛋白点进行了MALDI-TOF质谱鉴定,得分大于61(p0.05 )可确认蛋白质种类。分别是二氢嘧啶酶相关蛋白2(dihydropyrimidinase-related protein 2)、肌酸激酶(creatine kinase)、异戊酰-CoA脱氢酶(isovaleryl-CoA dehydrogenase)、翻译延长因子Ts(Ts translation elongation factor )、F1-ATPaseβ亚单位( F1-ATPase beta subunit)、3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase)、电子传递黄素蛋白α(Electron transfer flavoprotein alpha subunit)、烯酰CoA水解酶A链(Chain A, 2-Enoyl-Coa Hydratase)、NADH脱氢酶(泛醌)铁硫蛋白8(NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8)、原肌球蛋白β链(tropomyosin beta chain)。 8蛋白免疫印迹验证Western-blot结果显示:ATPaseβ亚单位(ATP5B)和电子传递黄素蛋白α(ETFA)在大鼠脑皮质线粒体中存在表达,而且两种蛋白在低压缺氧损伤后的变化趋势与双向电泳图像经PDQuest软件分析后得到的蛋白质变化趋势相一致。结论:1形态学观察发现,低压缺氧可造成大鼠脑皮质神经细胞损伤,包括细胞水肿、胞核固缩,坏死、凋亡和Nissl体减少或消失;其损伤程度随低压缺氧时间的延长而加重。2低压缺氧造成大鼠脑组织氧化应激损伤。SOD和CAT活性降低而MDA蓄积增加;LDH活性升高。3低压缺氧可引起脑、肺组织水通道蛋白表达改变,可能致使低压缺氧后大鼠脑、肺含水量增加,出现脑水肿、肺水肿,且水肿的严重程度随低压缺氧时间的延长而加剧。4低压缺氧可引起脑皮质线粒体蛋白质表达变化。各组脑皮质线粒体蛋白质表达存在差异,提示低压缺氧可引起众多线粒体蛋白因子表达发生变化,他们可能参与低压缺氧性脑损伤。低压缺氧可能引起脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化相关蛋白的改变,从而影响细胞能量代谢水平。低压缺氧可诱导线粒体的蛋白质分解及合成功能增强,以翻新因自由基等造成的线粒体结构蛋白的氧化性损伤。低压缺氧造成脑损伤的同时,脑组织也可能通过一系列代偿机制来应对损伤。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R-332

【参考文献】