异补骨脂甲素促小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞及相关机制研究

发布时间：2018-04-17 14:07

  本文选题：小鼠胚胎干细胞 + 神经分化　； 参考：《浙江大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的：探索异戊烯基黄酮异补骨脂甲素(Isobavachin, IBA)是否具有促小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)细胞定向分化为神经细胞的作用,并探索其相应的分化机制。 方法：采用悬滴培养4-/4+法模拟体内胚胎发育状态,形成拟胚体,继而进行贴壁培养。IBA以终浓度为10-7mol/L诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,10-7mol/L全反式维甲酸(Retinoic acid, RA)为阳性对照,0.1%二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。在分化培养终点,利用光镜和免疫荧光成像法鉴定神经元形成(轴突长度是胞体长度的3倍及以上)。收集ES细胞、拟胚体(embryoid bodies, EBs)、铺展培养d 8+0、d 8+5、d 8+10各时期细胞样本,用Western-blot以及RT-PCR法,评价神经细胞微管蛋白(β-tubulinⅢ)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP),作为ES细胞定向分化为神经细胞的指标；观察巢蛋白基因(nestin),神经纤维蛋白(NEFM),干细胞未分化状态基因(OCT3/4)等在各个神经分化时期表达特征。同时利用、Vestern-blot (?)去检测MAPK通路中p38, ERK, JNK磷酸化等相关分子事件的变化,以探索神经分化的可能机制。添加IBA时同步添加异戊稀基酶Ⅰ型抑制剂GGTI-298,通过条件摸索确定终浓度为10-6mol/L,观察其是否对IBA的促神经分化作用有影响,验证蛋白异戊稀化是否与IBA促小鼠ES细胞定向分化为神经细胞呈相关性。 结果：IBA诱导ES细胞分化为神经细胞过程中,光镜下多数呈典型神经元表型,即轴突长度是胞体长度的3倍及以上。免疫荧光成像结果表明,EBs期呈nestin,OCT3/4阳性表达；分化后期大多数呈神经元表型,并分别表达β-tubulinⅢ, ChAT,GABA等阳染,少量未呈神经元表型者GFAP阳染。Western blot (?)去观察在分化过程中,β-tubulinⅢ, GFAP表达均随分化时程延长而呈上调趋势,尤以β-tubulinⅢ阳性表达为甚。同步添加异戊稀基酶抑制剂GGTI-298能显著减少IBA促ES细胞分化为神经细胞,而未明显影响RA促神经细胞分化,提示两种化合物诱导神经分化作用机制不尽相同。MAPK通路中p38和JNK的磷酸化表达下调,ERK磷酸化表达上调,提示该通路不同蛋白的磷酸化与否与IBA诱导ES细胞分化为神经细胞呈相关性。 结论：IBA具有促进小鼠ES细胞定向分化为神经细胞的作用,主要为神经元,并有一定比例的星形胶质细胞,异戊稀基是IBA促神经分化的功能基团。IBA通过蛋白异戊烯化,下调MAPK通路中p38,JNK磷酸化,上调ERK磷酸化促进小鼠ES细胞定向分化为神经细胞。 目的：探索异补骨脂甲素(Isobavachin, IBA)促小鼠ES细胞神经元分化过程中是否伴随可兴奋细胞运动记忆相关蛋白Junctophilin 3,4(JP-3和JP-4)的表达。 方法：采用悬滴培养4-/4+法模拟体内胚胎发育状态,形成拟胚体(embryoid bodies, EBs),继而进行贴壁培养。IBA以终浓度为10-7mol/L诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,10-7mol/L全反式维甲酸(Retinoic acid, RA)为阳性对照,0.1%二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。在分化培养终点,利用光镜和免疫荧光成像法鉴定神经元,JP-3和JP-4的表达。收集ES、EBs、铺展培养d 8+0、d 8+5、d 8+10各时期细胞样本,用Western-blot法,评价神经细胞微管蛋白(β-tubulinⅢ)和运动记忆相关蛋白(JP-3和JP-4)的表达与叠加特征,作为ES细胞定向分化为可兴奋性神经细胞的指标。观察巢蛋白基因(nestin),干细胞多潜能基因(OCT3/4)等随着神经分化的变化特征。 结果：IBA诱导ES细胞分化为神经细胞过程中,免疫荧光成像表明,高度表达nestin的EBs同时高度表达JP-3和JP-4;随着神经分化时程,JP-3和JP-4逐步减少,分化末期d 8+10,DMSO组几乎无JP-3和JP-4表达,RA和IBA组尚有少量蛋白表达。JP-3和JP-4多数表达于神经元胞体中,鲜有出现在轴突及突触中。 结论：IBA促小鼠ES细胞分化的神经元具有表达运动记忆相关蛋白的功能。JP-3和JP-4在神经分化早期高度表达,成熟神经元表达量相对减少,且分布存在一定的区域性。
[Abstract]:Objective : To explore the effect of isobavachin ( IBA ) on the orientation and differentiation of embryonic stem ( ES ) cells into nerve cells and to explore its corresponding differentiation mechanism .

Methods : The embryonic development of mouse ES cells was simulated by suspension culture 4 - / 4 + method . The cells were cultured with IBA at a final concentration of 10 - 7 mol / L .
We observed the expression of nestin , NEFM and OCT3 / 4 in different stages of neurodifferentiation . In order to explore the possible mechanism of neurodifferentiation , we determined whether the final concentration was 10 - 6 mol / L by adding IBA to determine whether the final concentration was 10 - 6 mol / L .

Results : IBA induced ES cell differentiation into nerve cells , most of them were typical neuronal phenotype , that is , the axon length was 3 times or more of the cell length . Immunofluorescence imaging showed that EBs had nestin and OCT3 / 4 positive expression .
In the later stage of differentiation , most of the neurons were in neuronal phenotype , and the positive staining of 尾 - ATPase 鈪，

本文编号：1763916